Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

O objetivo geral deste procedimento é alterar a expressão gênica no sistema nervoso central embrionário do neurônio. Isso é realizado primeiramente obtendo fêmeas prenhes com tempo controlado e preparando-as para cirurgia. Os cornos uterinos são então expostos mediante a realização de uma incisão abdominal.

Uma vez expostos os embriões, o DNA é injetado no ventrículo lateral, no terceiro ventrículo ou no espaço subretiniano. O passo final do procedimento é aplicar uma corrente elétrica ao embrião através da parede uterina, orientando os eletrodos de forma que o polo positivo seja colocado sobre o local preferencial de transfeção. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram a proliferação, migração e diferenciação de progenitores neurais na linha kelon morrendo kelon e na retina por meio de microscopia de imunofluorescência.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a degeneração de camundongos transgênicos, é que ela é rápida, permite estudos de maior produtividade e tem um custo mais baixo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do desenvolvimento neural, como quais genes regulam os progenitores neurais, a proliferação celular, a especificação do destino celular, a diferenciação neuronal e a migração celular. As implicações desta técnica podem estender-se para uma melhor compreensão das vias genéticas que subjazem defeitos no desenvolvimento do sistema nervoso central, muitos dos quais resultam em comprometimento cognitivo e em transtornos comportamentais em humanos. Além de sua utilidade no entendimento do desenvolvimento do sistema nervoso central.

Essa técnica também pode ser aplicada a outros sistemas orgânicos, como o sistema nervoso periférico em desenvolvimento, coração e placenta. Pode ser também utilizada para estudar modelos de doenças em camundongos, bem como em outros organismos modelo, como galinha e xip. Geralmente, o principal obstáculo para o sucesso de indivíduos novos nessa técnica é o cuidado com a sobrevivência dos embriões, que deve ser tomado durante a manipulação, injeção e transferência dos embriões.

Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando precisamos de um meio rápido para manipular a expressão gênica no telencéfalo e na retina embrionários. Desenvolvemos esta técnica em nosso laboratório, modificando o método inicialmente descrito por Sal, publicado na revista Developmental Biology em 2001. Também trabalhamos com um laboratório de emergência para estabelecer este protocolo no dilon em desenvolvimento.

A demonstração visual deste método é essencial, pois os passos de injeção e eletroporação são difíceis de aprender, exigindo uma manipulação muito cuidadosa dos embriões, e os locais de injeção às vezes podem ser muito pequenos. Por exemplo, o espaço sub-retiniano. Quem demonstrará o procedimento hoje será Rajiv, pós-doutorando do Laboratório de Sherman. Para começar, limpe e esterilize todas as ferramentas cirúrgicas. Em seguida, encha seringas com solução salina e solução de Ringer lactato e coloque-as sobre uma placa de aquecimento para aquecer na área cirúrgica.

Sterilize um aquecedor com etanol 70% e, em seguida, cubra-o com uma gaze esterilizada e sem fiapos. Ajuste o aquecedor para 37 graus Celsius. Coloque o animal em uma pequena câmara anestésica e anestesie-o com a administração de 5% de isoflurano com oxigênio a um litro por minuto por meio de um vaporizador.

Certifique-se de coletar o exaustão de isóflurano usando um sistema de captura. Uma vez que a respiração do animal esteja profunda e regular, remova-o da câmara. Utilize o reflexo de pinçamento do dedo do pé e do piscar dos olhos.

Para garantir anestesia completa, posicione o animal anestesiado em decúbito ventral e utilize um tubo de respirador para administrar 2,25% de óxido de flúor durante a cirurgia. Administre buprenorfina na concentração de 0,1 miligramas por quilograma de peso corporal por via subcutânea na nuca.

Continue monitorando a respiração do animal e ajuste o fluxo de isoflurano, se necessário. Em seguida, fixe com fita a região torácica do animal anestesiado e verifique novamente a resposta de retração pinçando a pata traseira com pinça romba. Usando um cotonete estéril, espalhe uma camada espessa do creme de sobre o abdômen, garantindo que o pelo subjacente esteja completamente coberto.

Deixe o creme agir por aproximadamente três minutos e verifique intermitentemente a remoção dos pelos. Com um swab estéril, umedeça uma gaze estéril com água estéril e remova os pelos do abdome. Em seguida, esterilize o local da incisão com clorexidina e mais água.

Seque o abdômen com gaze estéril limpa. Repita este passo utilizando etanol 70% com gaze de algodão esterilizada fresca. Prepare-se para a cirurgia vestindo roupas cirúrgicas para expor os cornos uterinos.

Primeiro, localize o alba linear como a linha tênue sob a pele na linha média. Usando pinça, puxe a pele para longe da parede abdominal e faça uma pequena incisão reta do abdômen médio para baixo com tesoura de pele, utilizando pinça curva e tesoura. Repita o processo com o peritônio. Segure o peritônio com a pinça.

Puxe para afastar e, em seguida, faça uma incisão apenas grande o suficiente para puxar o útero através dela. Coloque uma gaze estéril com um pequeno corte vertical sobre a incisão e umedeça-a com soro fisiológico estéril morno. Em seguida, deslize a pinça para dentro da incisão e localize o útero, mantendo a incisão aberta com a pinça.

Segure o útero entre o primeiro e o segundo embriões visíveis e puxe ambas as extremidades dos cornos uterinos para a gaze. Conte o número de embriões, observando qualquer reabsorção ou embriões com tamanho corporal reduzido. Para preparar o número correto de injeções de DNA, umedeça os cornos uterinos com solução salina e devolva cuidadosamente um dos cornos uterinos ao abdômen.

Para carregar as agulhas cirúrgicas, use uma pipeta puxada para cima com um bocal acoplado para aspirar 10 microlitros de uma solução de três miligramas por mililitro. Solução de DNA livre de endotoxinas contendo corante verde metila e expelir o DNA para dentro de uma agulha cirúrgica. Fixe a primeira agulha cheia no micromanipulador.

Fique próximo ao injetor começando com o embrião mais próximo do ovário. Use pinças circulares para girar suavemente o embrião dentro da decídua, de modo que fique posicionado com a face voltada para frente, permitindo que as injeções sejam realizadas no sentido do rolamento ROS até a região cordal. Utilize uma fonte de luz de fibra óptica para identificar a linha média do cérebro embrionário.

Observe os grandes ventrículos laterais delimitados nas regiões rostrais. Mantenha o embrião no lugar usando pinças curvas e posicione a agulha cirúrgica cheia acima do útero, de modo que o ângulo de entrada no cérebro seja aproximadamente de 45 graus. Com um movimento rápido e firme, gire o botão no micromanipulador para inserir a ponta da agulha através da parede uterina e dentro do ventrículo lateral do cérebro embrionário.

Em seguida, pressione a alavanca do microinjetor. Para injetar a solução de DNA, uma injeção bem-sucedida é facilmente visualizada pela disseminação do corante verde de metila pelos ventrículos cerebrais embrionários. Agora que o DNA foi injetado, retire lentamente a agulha para removê-la sem causar ruptura.

Coloque o embrião injetado sobre a gaze estéril e umedeça completamente com soro fisiológico morno. Segure o útero com o polo positivo do eletrodo de placa posicionado sobre o local desejado de transfeção. Em seguida, aplique cinco pulsos elétricos quadrados de 40 a 50 volts e 50 milissegundos, numa frequência de um pulso por segundo.

Cubra o embrião injetado e eletroporado com gaze úmida protetora e, em seguida, prossiga para injetar o próximo embrião. Após concluir a injeção e eletroporação de todos os embriões desejados no corno uterino, empurre-o cuidadosamente de volta para a cavidade corporal. Remova o segundo corno uterino para iniciar a injeção e eletroporação dos embriões restantes.

Uma vez que todos os embriões estejam de volta dentro do útero, adicione dois a três mililitros de solução salina morna à cavidade abdominal e, em seguida, remova a gaze da região abdominal para expor as laterais do peritônio. Utilize fio de seda preta encaracolada para suturar o peritônio, fixando o fio no ponto do peritônio mais próximo ao esterno e continuando a costurar em direção oposta ao ponto de fixação. Certifique-se de que todas as suturas estejam firmes e de que nenhum órgão subjacente ou pele seja incorporado ao peritônio durante a sutura.

Corte a linha de sutura restante e descarte-a. Feche a pele sobre a linha de sutura com grampos cirúrgicos usando pinças. Aplique os grampos na pele tomando cuidado para não prender a linha de sutura por baixo ou para não tracionar a pele com muita força.

Uma vez concluído, assegure-se de que os grampos estão firmes pressionando suavemente com a ferramenta de sutura neste local, A-P-C-I-G. Um vetor de expressão dupla que induz a expressão de GFP foi eletroporado no neocórtex em desenvolvimento no estágio E 12. Conforme o desenvolvimento neocortical progride, os progenitores apicais se diferenciam em progenitores basais secundários ou em neurônios pós-mitóticos e continuam a expressar GFP. Essas células neurais podem então ser analisadas quanto à expressão de marcadores típicos do subtipo neural mostrado em vermelho.

Nesta vista ventral de um prosencéfalo de embrião eletroporado no estágio E12 e dissecado no estágio E14, o local eletroporado é indicado pela fluorescência epi verde observada no estágio E14. A expressão de GFP é observada no tálamo, pré-tálamo e hipotálamo, indicando que os territórios destinados a morrer foram transfectados com sucesso. A caixa tracejada marca a localização da secção através de uma zona ventricular.

Uma análise mais detalhada da zona ventricular mostra a migração de células GFP para fora da zona ventricular e em direção à zona da túnica. Onde os núcleos hipotalâmicos irão se formar, a retina embrionária também é facilmente eletroporada, conforme mostrado nesta seção coronal de um embrião E16,5 que foi eletroporado com PCIC no E15,5. Aqui, o acúmulo de células positivas para m-cherry é específico para a camada externa de neuroblastos e não é observado em células ganglionares da retina positivas para B rrn três B na camada de células ganglionares. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 30 minutos, caso não surjam complicações inesperadas.

Ao realizar este procedimento, é importante utilizar técnicas estéreis adequadas, manter a mão firme ao manipular os embriões e ter todos os materiais necessários preparados previamente antes de anestesiar a fêmea grávida. Após este procedimento, os embriões eletroporados podem ser mantidos vivos até a idade adulta, momento em que outros métodos, como ensaios comportamentais e funcionais, podem ser realizados para responder questões adicionais sobre como a manipulação de certos genes no embrião afeta a função neuronal no adulto. Desde o seu desenvolvimento, esta técnica tem aberto caminho para pesquisadores na área de desenvolvimento do SNC explorarem a função gênica in vivo em camundongos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como introduzir DNA estranho no tubo neural embrionário. Especificamente, mostramos como preparar uma fêmea grávida para cirurgia, expor o útero, injetar o DNA e eletroporar o embrião.

Não se esqueça de que trabalhar com isofluorano pode ser perigoso, e precauções como um sistema de captura devem ser tomadas ao realizar este procedimento.