Estudando Idade-dependente Instabilidade Genômica usando o S. cerevisiae Modelo Lifespan cronológica

O objetivo geral deste procedimento é estudar a instabilidade genômica dependente da idade em leveduras, combinando a longevidade cronológica com um conjunto de ensaios simples de dano ao DNA e mutação. Isso é realizado primeiramente coletando amostras de culturas envelhecidas cronologicamente a cada dois dias e verificando a viabilidade por meio da formação de unidades formadoras de colônias ou CFU. O próximo passo do procedimento é examinar as mutações no DNA coletando amostras de culturas envelhecidas e plaqueando células em meio de seleção específico para mutações.

Por fim, podem ser obtidos resultados que mostram alterações nas mutações de DNA durante o envelhecimento cronológico de leveduras, normalizando os resultados do ensaio de mutação pela viabilidade. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do envelhecimento, como os mecanismos que ligam envelhecimento e instabilidade genômica. Para realizar o ensaio de longevidade cronológica de leveduras, ou CLS, primeiramente inocular uma única colônia de levedura em um mililitro de meio sintético completo com glicose, ou meio SDC, e incubar durante a noite com agitação a 30 graus Celsius. No dia seguinte, diluir a cultura noturna em 10 mililitros de meio SDC fresco para uma OD 600 entre 0,05 e 0,1 e incubar com agitação a 30 graus Celsius por três dias.

No terceiro dia, quando as células estiverem em fase estacionária, dilua cada cultura Eloqua 10.000 vezes em água autoclavada, em seguida retire duas alíquotas de 10 microlitros do frasco e plaque 10 microlitros de cada cultura diluída em placa A-Y-E-P-D. Incube a placa a 30 graus Celsius até o surgimento de colônias. O número de colônias formadas, ou unidades formadoras de colônia, provenientes da cultura do terceiro dia é considerado como 100% de sobrevivência.

Continue removendo alíquotas da cultura envelhecida nos dias subsequentes para plaqueamento. Ajuste os fatores de diluição conforme necessário para garantir cerca de 20 a 100 colônias no ensaio de UFC. A coleta de amostras é interrompida quando a viabilidade da cultura diminui abaixo de 1%; tipicamente entre os dias 11 e 13, a viabilidade celular também pode ser estudada em células envelhecidas em placas.

Para iniciar este ensaio, inocular uma colônia isolada em um mililitro de meio sintético completo com glicose e incubar durante a noite com agitação a 30 graus Celsius. Quando a cultura tiver crescido até cerca de 10 elevado à oitava células por mililitro, diluir a cultura com água autoclavada para 100 a 200 células por 10 microlitros e 1000 células por 10 microlitros. Para cada linhagem, preparar um conjunto de oito a 20 placas de SDC sem triptofano rotuladas de acordo com a densidade de semeadura.

Para garantir a contagem de 10 a 100 colônias, antecipando a diminuição da viabilidade durante o envelhecimento, plaque dois alíquotas de 10 a 30 microlitros de cultura diluída em cada placa. Incube o conjunto de placas a 30 graus Celsius durante toda a análise de longevidade; no dia do plaqueamento e a cada dois dias subsequentemente, retire uma placa e adicione gota a gota 0,5 mililitros de triptofano para permitir o crescimento das células viáveis. Incube a placa a 30 graus Celsius por mais 48 a 72 horas.

Após 48 a 72 horas. Conte as UFC para a viabilidade do dia da adição de triptofano para ensaiar quatro danos ao DNA e frequência de mutação durante o envelhecimento cronológico. Vários mutantes com características especiais são cultivados em paralelo com a linhagem selvagem para o ensaio de CLS de levedura.

A frequência de mutação espontânea pode ser avaliada pela medição da frequência de resistência à canavanina em uma cultura envelhecida cronologicamente. Mutações no gene can1, que codifica a permease de arginina de membrana plasmática, tornam as células resistentes ao análogo de arginina L-canavanina. Células resistentes à canavanina crescerão em placas de meio sintético completo sem arginina, suplementadas com sulfato de L-canavanina. A medição da frequência de reversão trip+, em uma linhagem que contém uma mutação âmbar no gene trp1, permite a estimativa da taxa de substituição de bases durante o envelhecimento cronológico da levedura.

Células com reversão positiva crescerão em placas sem triptofano. A linhagem lyse negativa EH um 50 possui uma mudança de quadro de leitura de mais quatro, que resulta em auxotrofia para lisina, e isso pode ser revertido por pequenas inserções ou deleções. Os revertentes serão selecionados em placas sem lisina para detectar rearranjos cromossômicos grossos ou gcr.

Uma linhagem mutante é utilizada, na qual o HX T 13 localizado a 7,5 quilobases telomérica ao can um no cromossomo cinco é interrompido por um cassete U três. Mutações nos genes can um e U três tornam as células resistentes à L-canavanina e ao ácido 5-fluoroorótico, respectivamente. Como a frequência de mutações pontuais que ocorrem em ambos os genes é baixa, a análise da frequência de resistência à L-canavanina e ao ácido 5-fluoroorótico fornece uma estimativa de GCR. Para monitorar o nível de recombinação homóloga e não homóloga, durante o envelhecimento cronológico são gerados mutantes que carregam repetições invertidas homólogas de 100% ou de 91% de homologia.

A IRS no locus his três permite a recombinação entre a IRS, possibilitando a expressão da proteína funcional his três. Assim, as células nas quais ocorreu recombinação crescerão em placas sem histidina suplementadas com galactose. No terceiro dia, quando as células estiverem na fase estacionária, uma quantidade apropriada de células será removida de cada cultura envelhecida.

Como o mesmo procedimento é utilizado para todos os ensaios, apenas uma amostra será processada. Para fins deste vídeo, pelletize as células por centrifugação em uma centrífuga de bancada. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em um mililitro de água autoclavada.

Novamente, remova o sobrenatante e ressuspenda o pellet celular em 100 microlitros de água; plaque as células em placas apropriadas para seleção dos reversões desejadas. Incube as placas a 30 graus Celsius e, após três a quatro dias, conte as UFCs; a frequência de mutação é normalizada em relação ao número de células viáveis. Este gráfico mostra resultados representativos de um ensaio típico de longevidade cronológica, no qual a sobrevivência cronológica de células selvagens é comparada à de mutantes S. cerevisiae ΔTOR1 e ΔRAS2.

Em cultura líquida, mutantes que carecem de TOR um, CH nove ou RAs dois apresentam uma longevidade cronológica prolongada. Além disso, deficiências em s CH nove e RAs dois mostram um efeito aditivo na promoção da sobrevivência cronológica na presença de várias fontes de carbono. A utilização do ensaio de viabilidade NC dois é mostrada neste próximo gráfico.

No primeiro dia, culturas selvagens de SDC foram diluídas e semeadas em placas SC triplo dropout sem fonte de carbono. As placas SC triplo dropout suplementadas com glicose, etanol ou glicerol foram incubadas a 30 graus Celsius, com análise a cada dois dias. Uma placa foi retirada de cada conjunto e os nutrientes apropriados foram adicionados para permitir o crescimento e a formação de colônias.

A frequência de mutação dependente da idade varia bastante conforme a linhagem, background, manipulação genética, cultura, condições e idade. Esta tabela mostra resultados típicos obtidos em uma linhagem selvagem. Os resultados representativos da síntese translesão são mostrados nesta próxima imagem.

O aumento da frequência de mutações dependente da idade pode envolver alterações na reparação incorreta do DNA utilizando extratos nucleares e diversos modelos de DNA. Podemos avaliar a síntese de translesão ou TLS em células envelhecidas cronologicamente. Extratos nucleares de células de fase estacionária com três dias de idade, do tipo selvagem e do mutante SCH nove delta foram analisados.

Produtos de TLS com molde não danificado são indicados por linhas contínuas e produtos de TLS com molde danificado são indicados por linhas tracejadas. Não foi observada síntese translesão em extratos nucleares do mutante longevo s CH nine delta; os iniciadores livres são indicados pela seta aberta. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a análise do tempo de vida cronológico e de mutação do DNA em leveduras.