Ensaio de Dot Blot para quantificar o genoma viral

Para quantificar o DNA viral usando o ensaio de dot blot, comece com uma suspensão isolada de DNA viral. Trate com uma solução alcalina para desnaturar o DNA de fita dupla em fitas simples para hibridização subsequente.

Monte o aparelho de dot blot com uma membrana de náilon pré-umedecida. Carregue o DNA viral desnaturado e as soluções de DNA de plasmídeo padrão linearizado nos poços. Aplique um vácuo adequado, facilitando a transferência eficaz de DNA viral de fita simples com carga negativa e ligando-se à superfície da membrana carregada positivamente por meio de interações eletrostáticas, formando padrões de pontos.

Após a corrida, lave a membrana com tampão citrato de sódio, ajudando a melhorar a sensibilidade do ensaio. Após a secagem, exponha a membrana à luz ultravioleta, reticulando o DNA borrado com a membrana.

Adicione um fragmento de DNA não heterólogo desnaturado pelo calor e uma suspensão de sonda de DNA marcada com fósforo radioativo específica do genoma viral em tampão de hibridização à membrana. Incubar, facilitando a hibridização.

Os fragmentos de DNA atuam como agentes bloqueadores, ligando-se às demais regiões da membrana, minimizando a ligação não específica da sonda. A sonda radioativa hibridiza com a sequência complementar no DNA viral de fita simples.

Lave com tampão de lavagem para remover sondas não hibridizadas. Usando o sistema de varredura de imagem de fósforo, quantifique os sinais radioativos emitidos pelas sondas radioativas hibridizadas com o genoma viral na membrana, para obter sinais de dot blot.

A partir da curva padrão, a intensidade do sinal de cada ponto na membrana pode ser usada para calcular a quantidade de DNA viral na amostra.

Para realizar o ensaio de dot blot, prepare padrões de DNA de plasmídeo diluindo o DNA do plasmídeo do genoma do vetor AAV a 10 nanogramas por microlitro em água ou tampão Tris-HCl. Transferir uma alíquota de 25 microlitros do ADN plasmidial diluído para um novo tubo e linearizá-la com uma enzima de restrição apropriada num volume de reacção de 50 microlitros durante uma hora.

Adicione 450 microlitros de água ou TE ao tubo que contém o padrão de DNA do plasmídeo digerido e misture bem. Em seguida, transfira 70 microlitros dessa mistura para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com 1.330 microlitros de água ou TE para fazer um padrão de plasmídeo diluído.

Para configurar o aparelho de mancha de pontos, usando uma tesoura, corte a membrana de mancha em um tamanho apropriado para o número de amostras e padrões. Mergulhe a membrana com água por 10 minutos, antes de colocá-la no aparelho de mancha de pontos. Em seguida, cubra os poços não utilizados. Adicione água aos poços para os quais as amostras serão carregadas. Aplique um aspirador, puxe a água pelos poços, verifique se há erros e reaperte os parafusos. Teste novamente, se necessário.

Aplique 400 microlitros de cada padrão de DNA de plasmídeo diluído em cada poço e execute quatro pistas de diluições padrão. Use duas alíquotas separadas do resumo padrão e coloque cada uma em duplicata. Em seguida, aplique 200 microlitros por poço de cada amostra de DNA viral. Aplique um vácuo suave para agrupar as soluções de DNA através dos poços. Então, uma vez que todos os poços tenham esvaziado, libere o vácuo ajustando a válvula de três vias.

Adicione 400 microlitros de solução alcalina 1X a cada poço. Em seguida, aguarde cinco minutos antes de reaplicar o vácuo para esvaziar os poços. Reaplique o vácuo e desmonte o aparelho de dot blot. Em seguida, remova a membrana e enxágue com 2X SSC.

Coloque a membrana em uma toalha de papel limpa, com o lado ligado ao DNA voltado para cima, para remover o excesso de tamponamento. Use um reticulador UV apropriado para reticular o DNA borrado com a membrana. A membrana agora está pronta para hibridização.

Coloque a membrana em um frasco de hibridização com o lado ligado ao DNA para cima. Enxágue a membrana com 5 a 10 mililitros de tampão de hibridização pré-aquecido e descarte o tampão. Em seguida, adicione 10 mililitros de tampão de hibridização pré-aquecido e coloque a garrafa em um forno de hibridização rotativo ajustado para 65 graus Celsius. Gire a garrafa por pelo menos cinco minutos.

Adicione rapidamente o DNA do esperma desnaturado e a sonda radioativa ao tampão de hibridização no frasco e agite-o por 10 segundos para misturar. Retorne a garrafa ao forno a 65 graus Celsius e incube-a com rotação a 65 graus Celsius por pelo menos quatro horas.

Quando a hibridização estiver concluída, pare a rotação, remova o frasco de hibridização e, em seguida, despeje a solução de sonda radioativa em um tubo cônico de 50 mililitros com uma tampa de vedação de plugue à prova de vazamentos. Para lavar a membrana, adicione 20 a 30 microlitros de tampão de lavagem pré-aquecido ao frasco de hibridização e gire-o por cinco minutos. Repita esta lavagem mais duas vezes.

Após a terceira lavagem, remova a membrana do frasco de hibridização e, com papel toalha, remova o excesso de tampão da membrana. Em seguida, coloque a membrana em um suporte de papel plástico transparente. Com um contador Geiger, verifique os sinais radioativos na membrana.

[TRILLING]

Depois de expor a tela de imagem de fósforo apagada à membrana, digitalize a tela usando um sistema de digitalização de imagem de fósforo e obtenha os dados sobre a intensidade do sinal de cada ponto.