Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica
18 de julho de 2011
Um modo de tocar microscópio de força atômica método (AFM) para a visualização de DNA plasmídeo, proteínas citoplasmáticas e proteína-DNA complexos é descrito. O método inclui abordagens alternativas para a preparação de amostras para AFM imagem após a manipulação bioquímica. DNA contendo regiões específicas interagindo proteínas são observados em condições quase fisiológica buffer.
O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de biomoléculas, como DNA e proteínas, em tampões aquosos em tempo real utilizando microscopia de força atômica. Isso é realizado primeiramente preparando as biomoléculas a serem visualizadas. Em seguida, configura-se o microscópio de força atômica e posiciona-se uma ponteira de cantiléver em modo FM.
A superfície da amostra e as biomoléculas de interesse são então imagiadas e analisadas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o tamanho geral, a quantidade e a organização de DNA, proteínas e complexos biomoleculares heterogêneos em condições tamponadas por meio de microscopia de força atômica. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo das chaperonas moleculares, como qual é a geometria STO do complexo entre chaperonas e co-chaperonas com um cliente.
Proteína A demonstração visual deste método é benéfica, pois os passos de preparação da microscopia de força atômica (AFM) e da sonda Kent podem ser difíceis de aprender a partir de instruções impressas, principalmente devido às complexidades associadas à sua manipulação física. O procedimento será demonstrado por Morgan Shannon e John Gertz, dois alunos do meu laboratório. Para começar, isole as moléculas de proteína ou DNA a serem imagiadas e suspenda-as em um tampão aquoso. Após confirmar a pureza da amostra, incube-a em um tampão de absorção para AFM no gelo para promover a adesão da amostra à mica.
Para amostras de proteínas, utilize um tampão heaps de 10 milimolares. E para DNA, um tampão contendo magnésio composto de tris 10 milimolares, pH 7,5, cloreto de sódio 10 milimolares, cloreto de magnésio 2 milimolares é adequado para montar a sonda de MF. Coloque o suporte da sonda da célula líquida na estação de acoplamento correspondente para instalação do canteiro.
Localize a longa alavanca grossa da sonda de alavanca de nitreto afiada a ser utilizada para imageamento. Transfira-a cuidadosamente para o suporte da sonda da célula líquida, garantindo que a ponta permaneça voltada para cima. Em seguida, examine a alavanca sob um microscópio óptico para garantir que esteja intacta e corretamente acomodada no suporte da sonda da célula líquida.
Em seguida, remova cuidadosamente a cabeça de FM do conjunto de encaixe do instrumento apertando o parafuso de fixação da cabeça neural. Inverta a cabeça de FM e empurre firmemente o suporte da sonda da célula líquida sobre os quatro pinos na base da cabeça de FM. Por fim, recoloque cuidadosamente a cabeça de FM no conjunto de encaixe do instrumento.
Para preparar ainda mais o microscópio de força atômica (FM) antes da imagem de amostras, mova os botões do microscópio óptico embutido para localizar a ponta do cantiléver e ajuste as setas para cima e para baixo do controlador óptico no software para colocar a ponta do cantiléver em foco. Use os botões de ajuste do laser para alinhar o laser com a ponta do cantiléver. Este é um dos passos mais tecnicamente desafiadores do protocolo; o posicionamento é feito manualmente e exige ajustes precisos dos botões.
O monitoramento cuidadoso do laser no ponto de reflexão e no ponto de iluminação aumenta a probabilidade de um alinhamento bem-sucedido. Em seguida, ajuste os botões do fotodetector na cabeça de FM para centralizar o fotodetector. Coloque uma lâmina recém-clivada de MICA, presa a um disco metálico de amostra de FM, no porta-amostras magnetizado localizado sobre a placa do suporte de FM.
Gire a placa do suporte FM para que o disco de espécime fique posicionado para a imagem inicial. Use o controle de superfície de foco do software do instrumento para mover a cabeça FM em direção à superfície do disco de espécime MICA. Até que características distintas na superfície do MICA ou o reflexo da ponta estejam em foco, selecione o ícone de ajuste no software do instrumento e ajuste o cantiléver.
A frequência de ressonância das sondas MSNL ou SNL recomendadas é de 20 a 60 quilohertz. Selecione uma compensação de pico de 5% para imagens da amostra de MICA. Primeiro, posicione a sonda sobre a superfície de MICA, defina o tamanho inicial de varredura para 10 micrômetros e a taxa de varredura para um hertz.
Capture imagens completas da digitalização do campo de 10 micrômetros. Em seguida, reduza o tamanho da digitalização para cinco, um e 0,5 micrômetros e capture imagens completas de cada campo. Desengate a sonda clicando uma vez no ícone de desengate no software do instrumento.
Para imaginar biomoléculas de interesse, misture cinco microlitros da amostra preparada com 45 microlitros de tampão de absorção fresco. Adicione cuidadosamente 50 microlitros da solução contendo 0,5 micrograma por mililitro da biomolécula diretamente sobre a superfície dos MICUs. Aguarde cinco minutos para permitir que as biomoléculas da amostra adiram à superfície de Micah.
Em seguida, pipete de 50 a 100 microlitros adicionais de tampão de absorção no suporte da célula de líquido. Tendo o cuidado de não tocar a sonda, uma cabeça FM ou a MICA com a ponteira da pipeta, reajuste o detector de foto e realinhe o laser com o cantiléver conforme necessário. Em seguida, use o software do instrumento para reengajar a sonda.
Aumente o tamanho da varredura para identificar regiões de interesse. Após a conclusão da imagem, selecione o ícone de retirada no software do instrumento várias vezes para desengatar a sonda. Por fim, use água destilada para enxaguar completamente o suporte da sonda da célula líquida e o disco da amostra.
Em seguida, teste com ar comprimido. Um exemplo de uma imagem de FM-A é mostrado aqui. O substrato de mica fornece uma superfície molecularmente plana na qual o DNA e as proteínas podem absorver.
A imagem do MICA antes das amostras de biomoléculas fornece um controle negativo e uma avaliação do ruído de imagem. Também oferece um nível de garantia de que o cantiléver está devidamente calibrado e que a imagem subsequente da amostra será bem-sucedida. O DNA plasmidial de dupla fita, presumivelmente superenrolado, é prontamente identificado por sua aparência assimétrica e deposição uniforme sobre o substrato de Micah previamente inócuo.
Complexos proteicos de tamanhos de partículas discretos também são exclusivamente distinguíveis do substrato Micah. Diferenças no tamanho das partículas indicam heterogeneidade da amostra e podem ser úteis para estimar a estequiometria, geometria ou atividade bioquímica do complexo proteico. A forma diagonal geral e a orientação consistente das partículas proteicas observadas.
Aqui é um artefato de imagem, já que as proteínas seriam orientadas no substrato Micah de maneira aleatória. As causas possíveis do artefato observado incluem uma anormalidade física na ponta ou uma imagem de FM com uma taxa de varredura muito rápida, enquanto a convolução da ponta impede cálculos precisos de medidas de comprimento nos eixos X e Y, ou medidas de altura no eixo Z; contudo, medidas relativas nos eixos X e Y podem ser úteis para estimar propriedades biofísicas das biomoléculas imagiadas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de sintonizar com precisão o cantiléver e alinhar o detector fotônico, seguindo este procedimento básico de FM.
Outras etapas, incluindo o uso de uma célula de fluido para troca de tampão, podem ser adicionadas para responder perguntas adicionais, como a capacidade de chaperonas moleculares de afetar a liberação de receptores de esteroides de seus elementos de resposta no DNA. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão melhor de como obter imagens de proteínas de DNA e complexos biomoleculares utilizando microscopia de força atômica em condições tamponadas.
Visão Geral
Este artigo descreve um método de microscopia de força atômica (AFM) em modo de batimento para visualizar biomoléculas, como DNA plasmidial e proteínas, em condições de tampão próximas às fisiológicas. O método inclui técnicas de preparação de amostras que melhoram a qualidade e a precisão da imagem.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biofísica
- Bioquímica
Contexto
- A microscopia de força atômica (AFM) é uma ferramenta poderosa para a obtenção de imagens de biomoléculas.
- Compreender as interações entre DNA e proteínas é fundamental na biologia molecular.
- A preparação da amostra é essencial para um bom desempenho na imagem por AFM.
- A obtenção de imagens em tempo real em condições tamponadas pode fornecer informações sobre estruturas biomoleculares.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para imagear DNA e proteínas em tampões aquosos utilizando AFM.
- Visualizar complexos de DNA-proteína e sua organização.
- Facilitar a compreensão das interações de chaperonas moleculares.
Métodos Utilizados
- Preparação de biomoléculas em tampões apropriados.
- Configuração e calibração do instrumento de AFM.
- Obtenção de imagens de amostras em um substrato de mica.
- Análise do tamanho, quantidade e organização das biomoléculas.
Resultados Principais
- Imagem bem-sucedida de DNA plasmidial de fita dupla e complexos de proteínas.
- Identificação da heterogeneidade da amostra por meio de diferenças no tamanho das partículas.
- Visualização da organização de DNA e proteínas na superfície da mica.
- Demonstração da eficácia do método em imagens em tempo real.
Conclusões
- O método de AFM fornece informações valiosas sobre interações biomoleculares.
- A preparação da amostra é fundamental para obter resultados de imagem de alta qualidade.
- Essa técnica pode avançar a pesquisa em estudos de chaperonas moleculares.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microscopia de força atômica (AFM) permite a visualização direta de DNA recombinante, proteínas e seus complexos em condições de tampão próximas às fisiológicas, auxiliando na desmistificação mecanicista inicial e na validação de alvos. Essa capacidade fornece às equipes de P&D de biofármacos informações estruturais de alta resolução e sem marcação, essenciais para compreender interações biomoleculares e a montagem de complexos. A integração da imagem de AFM nos fluxos de trabalho de descoberta aumenta a confiança preditiva e orienta decisões de triagem de portfólio em pontos críticos de inflexão.
Aplicações Estratégicas em P&D Biofarmacêutico
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- A visualização direta de complexos DNA-proteína e proteína-proteína esclarece a montagem molecular e a especificidade das interações.
- A imagem por microscopia de força atômica (AFM) apoia a validação funcional de alvos ao revelar a estequiometria e a heterogeneidade dos complexos.
- O mapeamento estrutural de complexos biomoleculares reduz a ambiguidade mecanicista na seleção de alvos.
- A imagem sem marcadores em condições tamponadas preserva as conformações nativas para testes de hipóteses precisos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- A AFM fornece dados topográficos quantitativos para avaliar a homogeneidade da amostra e a formação de complexos.
- As imagens obtidas permitem a padronização de preparações de biomoléculas para ensaios subsequentes.
- A visualização em tempo real favorece a reprodutibilidade e a prontidão do ensaio para campanhas de triagem.
- A adaptabilidade da plataforma permite seu reuso em diversos alvos proteicos e de ácidos nucleicos.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- A imagem por AFM orienta a seleção de modelos pré-clínicos ao caracterizar agregados biomoleculares relevantes para a doença.
- As perspectivas estruturais apoiam o alinhamento translacional de biomarcadores quando a formação de complexos está ligada a resultados funcionais.
- Medições quantitativas orientam decisões de avanço ajustadas ao risco em fluxos de trabalho pré-clínicos.
- A redução de riscos mecanicistas é viabilizada pela observação direta de interações moleculares em condições fisiológicas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A microscopia de força atômica se insere no continuum de descoberta, desde a verificação inicial de hipóteses até a identificação de compostos promissores e a validação pré-clínica, fornecendo uma capacidade analítica reutilizável para interrogatório estrutural.
- Biologia da Descoberta: Permite o mapeamento orientado por hipóteses de interações proteína-DNA e proteína-proteína no nível de única molécula.
- Triagem: Fornece saídas de imagem quantitativas e reprodutíveis para avaliar o desempenho do ensaio e a qualidade da amostra.
- Análises: Fornece dados topográficos e dimensionais para análise comparativa de complexos biomoleculares.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade ao vincular características estruturais a desfechos funcionais e relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Adaptável a uma ampla gama de biomoléculas, apoiando múltiplos programas e alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a incerteza mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho de imagem e melhora a reprodutibilidade entre equipes.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir/não prosseguir e otimiza a alocação de recursos ao esclarecer montagens complexas.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco e o avanço de alvos validados estruturalmente.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em operação de AFM, ajuste de cantiléver e preparação de amostras.
- Exige acesso a instrumentação de AFM de alta resolução e software analítico.
- A padronização entre equipes é essencial para obtenção de imagens reprodutíveis e interpretação de dados confiável.
- A composição do tampão e a seleção do substrato devem ser otimizadas para cada tipo de biomolécula.
- A convolução da ponta e as limitações na taxa de varredura podem afetar as medidas dimensionais absolutas.
