Teste de susceptibilidade antimicrobiana do complexo Mycobacterium tuberculosis da Droga primeira e segunda linha de diluição em caldo em um formato de placa de microtitulação

Existem relativamente poucos medicamentos disponíveis para tratar o Mycobacterium tuberculosis, portanto, a resistência a qualquer fármaco é uma preocupação. Este artigo em vídeo descreve um procedimento para testar a resistência antibiótica do M. tuberculosis a 12 medicamentos antimicrobianos diferentes simultaneamente. Assim, a capacidade de detectar rapidamente a resistência antimicrobiana do M. tuberculosis é muito importante no esforço para controlar o aumento de cepas resistentes. Aqui, para testar a suscetibilidade aos antibióticos.

M. tuberculosis é inicialmente cultivado em meio sólido ou em caldo, uma suspensão bacteriana. O inóculo é preparado e adicionado a uma placa de microtitulação contendo diferentes concentrações de 12 fármacos, incluindo medicamentos de primeira e segunda linha. Após a incubação, o grau de crescimento em cada poço é determinado manualmente com o auxílio de uma caixa de espelhos ou por meio de um leitor de placas semiautomatizado.

Os dados resultantes indicam a concentração inibitória mínima para cada medicamento testado e mostram a quais antibióticos a cepa testada de TB é resistente. Esses resultados auxiliam na escolha do medicamento apropriado para o tratamento da TB. Olá, meu nome é Nancy Ek e sou diretora do Laboratório de Micobacteriologia da Clínica Mayo em Rochester, Minnesota.

Hoje vamos descrever um método para realização de testes de suscetibilidade a antibióticos para Mycobacterium tuberculosis. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como a diluição em caldo macro, é que uma MIC é determinada para cada fármaco e 12 antibióticos são testados simultaneamente. A demonstração do procedimento será feita por Kurt Jude, especialista em controle de qualidade do meu laboratório, trabalhando em uma bancada de laboratório.

Prepare-se para este procedimento rotulando uma placa de ágar sangue, três placas Middlebrooks sete H 10, um tubo de vidro com esferas de vidro contendo salina tween e uma placa de microtitulação com o nome do paciente e o número de identificação da amostra. Além disso, rotule as placas de ágar sangue e as placas sete H 10 como pureza. Marque uma dessas placas sete H 10 como contagem de colônias um para um e a outra como contagem de colônias um para 50.

Em seguida, coloque a bandeja no pass-through. Depois, prepare-se para trabalhar na instalação de biossegurança nível três (BSL-3) colocando uma capa com frente fechada, touca, luvas, capas para sapatos e um respirador. Aqui, utiliza-se um respirador PAPR.

Em seguida, retire a bandeja do pass-through. Depois, na instalação de BSL 3, desinfete a superfície da cabine de segurança biológica. Em seguida, coloque uma toalha de papel embebida com desinfetante dentro da capela, aproximadamente a seis polegadas do painel do ventilador de ar, ao lado da toalha de papel.

Coloque alças de inoculação, pipetas e ponteiras, um recipiente apropriado para descarte de resíduos, um néfi, TER e um vórtex. Após o preparo da cabine, posicione o organismo sobre a toalha de papel juntamente com um suporte contendo um padrão McFarland 0,5, um caldo sete H nove com OADC e um tubo de bolas salinas. Esta montagem é feita a partir de meio sólido.

Prepare o inóculo a partir de uma cultura em meio sólido obtida de uma amostra do paciente. Use um alça estéril para raspar as colônias e transferi-las para o tubo de vidro contendo salina com tween e esferas de vidro. Vortexe a suspensão por 30 a 60 segundos.

Inspecione visualmente a amostra, comparando-a ao padrão de McFarland. A quantidade transferida deve ser igual ou maior que a do padrão. Caso contrário, adicione mais da amostra bacteriana e vortexe novamente.

Uma vez que o padrão de McFarland seja ajustado, deixe o inóculo decantar por 15 minutos para permitir que os agregados maiores de bactérias sedimentem. Em seguida, utilize um nefi TER para zerar a densidade das bactérias em suspensão. O nephi ter.

Primeiro, coloque um tubo em branco com perlas salinas Tween no Nephi ter. Pressione o botão de calibração para zerar o instrumento, depois coloque o padrão McFarland 0,5 no Nephi ter e pressione o botão de calibração novamente. Após a calibração do instrumento, remova o padrão McFarland e insira o inóculo.

A leitura do inóculo deve ser igual à leitura do padrão de McFarland. Se a leitura for muito baixa, remova o tubo e transfira mais bactérias da placa. Em seguida, vortexe e leia a amostra novamente.

Se a leitura for muito alta, adicione salina tween ao tubo e vortex. Em seguida, leia a amostra novamente. Continue ajustando o inóculo conforme necessário até que a concentração das bactérias corresponda ao padrão de McFarland.

Em seguida, utilize uma pipeta de 200 microlitros e uma ponteira longa resistente a aerossóis para remover 100 microlitros do inóculo do terço superior do tubo. Para evitar grumos que estejam sedimentando no fundo, inocular o caldo Middlebrook 7H9 e vórtexar lentamente o caldo inoculado por 20 segundos para plaquear o inóculo. Comece removendo a placa de microtitulação da embalagem do fabricante. Se o dessecante estiver azul ou se a embalagem de folha estiver danificada, não a utilize.

A placa já contém os 12 antimicrobianos a serem testados em cada poço, incluindo as drogas mais eficazes ou de primeira linha e as drogas de segunda linha. Despeje cuidadosamente o inóculo de caldo H nove em um trth, tomando cuidado para não gerar aerossóis. Em seguida, posicione a placa de microtitulação com o rótulo voltado para fora, como mostrado aqui, e use um pipetador de 12 canais para adicionar 100 microlitros do inóculo a cada poço.

Em seguida, prepare placas para realizar contagens de colônias. Primeiro, prepare uma placa não diluída transferindo um alça de um microlitro da amostra do poço do controle positivo para a placa H 10 sete rotulada um para um. Em seguida, use a alça para semear a placa conforme mostrado aqui.

Em seguida, para preparar uma diluição de um para 50, transfira um alça de um microlitro do poço controle positivo e agite-a no tubo contendo 50 microlitros de água de estria. Coloque um microlitro dessa diluição na placa rotulada um para 50. Inocule as placas de pureza pipetando 50 microlitros do inóculo do trth para placas de ágar sangue e placas 7 H 10 devidamente rotuladas e estrie para isolamento.

Em seguida, empilhe outro trth sobre o trth inoculado e coloque-os suavemente no recipiente de descarte. Coloque um selo adesivo na placa de microtitulação. Depois, utilizando o suporte branco, pressione firmemente cada poço para garantir um vedamento adequado, assegurando que não haja dobras.

Desinfete a placa de microtitulação limpando-a com uma toalha de papel embebida em desinfetante bactericida para tuberculose. Em seguida, coloque a placa de microtitulação em um saco plástico e feche-o com selagem térmica. Por fim, desinfete todos os materiais, incluindo o nefi, o vórtex, as placas e os tubos, limpando-os com um desinfetante bactericida para tuberculose.

Aqui, o pro spray é usado após um tempo suficiente ter passado para garantir a desinfecção. 15 minutos para o pro spray. As placas são vedadas com fita adesiva, colocadas em sacos plásticos e os materiais selados são removidos da cabine de segurança biológica e colocados na câmara de passagem.

O saco vermelho de descarte é fechado e selado com um prendedor de torção neste momento, retire o avental, as sapatilhas e as luvas. Após seguir para a sala de antecâmara e lavar as mãos, remova o respirador, desinfete-o e guarde-o após lavar as mãos novamente, coloque um avental novo e saia da sala de nível de biossegurança três. Em seguida, o recipiente de descarte é autoclavado.

A seguir, incubar a placa de microtitulação e as sete placas H 10 e de escavação sanguínea com a face para cima no incubador a 35 a 37 graus Celsius com 5 a 10% de CO2 no laboratório BSL dois. Isso é aceitável porque a placa está bem selada e dentro de um saco plástico. O tempo de geração do Mycobacterium tuberculosis é de aproximadamente 12 a 24 horas, portanto, será necessário pelo menos uma semana antes que o crescimento possa ser observado na forma de um pellet celular no fundo do poço controle. No dia 10, realizar uma leitura manual com espelho colocando a placa selada de microtitulação AST na plataforma da caixa de espelho.

Use uma lâmpada de mesa para ajudar a visualizar o crescimento, ajustando conforme necessário para obter o melhor contraste. Verifique os poços de controle de crescimento, neste caso, H 11 e H 12, observando no espelho. Se houver crescimento, o poço parecerá turvo ou parecerá ter sedimento, como mostrado aqui.

Se não houver crescimento, como mostrado neste exemplo, o poço parecerá estar claro. Nesse caso, devolva a placa ao incubador e continue a incubação por até 21 dias. Para cada condição, compare o crescimento com o controle.

Bem, então, para cada registro de medicamento, a primeira diluição que não apresenta crescimento. Esta é a concentração inibitória mínima, ou CIM, do medicamento para examinar os resultados usando um leitor automático de placas, como o Vision. Comece abrindo o software Myco TB a ST Plate e fazendo login. Coloque a placa selada com o código de barras voltado para fora. Conforme mostrado aqui, o crescimento aparece como turvação ou como um depósito de células no fundo de um poço na tela do computador.

Primeiro, examine os controles de crescimento. Como antes. Se este for negativo para crescimento, devolva a placa ao incubador por até 21 dias.

Se for positivo, registre os resultados tocando no primeiro poço que não apresenta crescimento na tela, para cada medicamento. Em alguns casos, bactérias, sedimento ou medicamentos precipitam no fundo do poço. Esse fenômeno, conhecido como trailing, é indicado por vários poços com pelotas do mesmo tamanho e não é considerado crescimento positivo.

Em seguida, as sete placas de H 10 e ágar sangue são examinadas para determinar as concentrações bacterianas e avaliar a pureza. A placa de ágar sangue não deve apresentar crescimento após 48 horas. O crescimento na placa de ágar sangue indica contaminação com bactérias de crescimento rápido.

Se houver crescimento, o teste em microplaca deve ser repetido. A placa de pureza H 10 deve apresentar crescimento de um único organismo. O tipo EM de tuberculose deve parecer acastanhado, colorido, enrugado e áspero. Se houver contaminação, o teste em microplaca precisa ser repetido a partir de uma cultura pura.

Para avaliar a concentração bacteriana, conte as colônias na placa H 10 sete. Em seguida, utilizando a tabela no documento escrito anexo, calcule as contagens de colônias. Mycobacterium tuberculosis foi cultivado a partir de um espécime de paciente e a resistência a antibióticos foi avaliada conforme descrito neste vídeo; na placa mostrada aqui, 12 medicamentos diferentes estão presentes em concentrações crescentes, com as concentrações mais altas na parte superior e as mais baixas na parte inferior.

A concentração inibitória mínima, ou CIM do fármaco, foi indicada pela menor concentração do fármaco que não apresentou qualquer crescimento e está circulada na imagem mostrada aqui, utilizando pontos de corte padronizados estabelecidos pelo Clinical and Laboratory Standards Institute. Os dados aqui apresentados sugerem que esta cepa de TB será resistente à Isid e à Rifampina. In vitro, as altas CIMs observadas em diversos outros fármacos, incluindo oin, moxifloxacina, estreptomicina e rifabutina, sugerem a resistência da cepa de tuberculose EM a esses agentes.

Os resultados do MIC devem ser utilizados por um especialista em doenças infecciosas com experiência no tratamento da tuberculose para desenvolver um plano de tratamento individualizado. Uma vez dominada, esta técnica leva cerca de 40 minutos para preparar um isolado. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que este é um patógeno respiratório e que, ao realizar a semeadura, você pode gerar aerossóis. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o teste de suscetibilidade antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis utilizando o método de microdiluição em caldo. Não se esqueça de que trabalhar com Mycobacterium tuberculosis pode ser extremamente perigoso, e precauções, como proteção respiratória, devem sempre ser tomadas quando exigidas.