Mapeamento Inibitória Circuitos Neuronal por Laser Scanning fotoestimulação

O objetivo geral deste procedimento é investigar a organização funcional local da circuitaria neuronal inibitória. O procedimento começa com a preparação de fatias cerebrais vivas do córtex somatossensorial primário de camundongos. O próximo passo é visualizar e registrar atividade de tipos celulares inibitórios que expressam GFP direcionado na fatia cerebral.

Após essa estimulação fotônica por varredura a laser por meio do glutamato, utiliza-se a liberação fotoativa para ativar pequenos grupos de neurônios pré-sinápticos como excitatórios ou inibitórios. As correntes pós-sinápticas são registradas nos interneurônios que expressam GFP. O passo final consiste em realizar a estimulação fotônica, analisar os dados e gerar mapas quantitativos da entrada sináptica para os neurônios registrados.

No fim das contas, a estimulação fotônica por varredura a laser combinada com gravações de células inteiras permite a construção de mapas detalhados de entradas sinápticas para tipos específicos de neurônios inibitórios, o que pode possibilitar a determinação da organização e função de circuitos corticais inibitórios locais. A técnica baseada em estimulação fotônica foi desenvolvida inicialmente pelo Dr. Larry Katz, Ned Calloway, e posteriormente aprimorada pela Dra. Carols Waboda, minha orientadora, com quem o Dr. Xing Z se especializou no Instituto Salk, onde liderou diversos estudos sobre circuitos interorais. Atualmente, nosso grupo está ampliando e continuando esses estudos, investigando circuitos interorais.

Para iniciar este procedimento, sacrifique um camundongo transgênico na fase pós-natal de duas a três semanas por decapitação e remova rapidamente o cérebro, colocando-o em uma solução de corte congelada e oxigenada. Em seguida, use óculos GFP para examinar visualmente o cérebro e verificar a expressão de GFP. A seguir, corte o córtex somatossensorial primário em seções de 400 micrômetros de espessura com um vibrátomo.

Incube as fatias no A CSF contendo sacarose borbulhado com 95%O₂ e 5%CO₂ a 32 graus Celsius por 30 minutos a uma hora. Após isso, transfira as fatias para o A CSF comum à temperatura ambiente para preparar o laser para o experimento, ligue o sistema de refrigeração do laser e a fonte de alimentação. Em seguida, ligue todo o equipamento relacionado ao controle de fotoestimulação, incluindo o sistema de espelho de varredura, modulador óptico e obturador eletrônico, e um amplificador de entrada de fotodiodo.

Em seguida, ligue os equipamentos eletrofisiológicos, como o amplificador Multi Clamp 700B e os micromanipuladores. As gravações eletrofisiológicas, a fotoestimulação e o imageamento são realizados na câmara de perfusão de fatias montada sobre a platina motorizada do microscópio. Depois disso, ligue a câmera de imageamento; a fatia será visualizada no microscópio ereto com óptica infravermelha DIC e epifluorescente por meio do sistema de imageamento.

Em seguida, abra o software FS baseado em MATLAB e o software de captura da câmera Q no monitor. Antes de executar o experimento, verifique o sistema de estimulação fotônica a laser e certifique-se de que ele está em estado de funcionamento. Coloque um pedaço de papel sob a objetiva do microscópio 4x para observar o padrão de varredura do laser enquanto o sistema estiver em funcionamento.

Para fabricar o microeletrodo com resistência de quatro a seis megaohms, puxe um eletrodo de vidro utilizando o puxador de micropipetas. Em seguida, preencha o eletrodo com uma solução interna contendo 0,1% de biotina para marcação celular e identificação morfológica. Depois, ligue o sistema de perfusão pressurizado para bombear o ACSF para dentro da câmara.

Mantenha um nível constante de fluido de 2,0 milímetros acima da fatia na câmara. Uma alíquota da solução estoque de glutamato enjaulado MNI é adicionada a 25 mililitros de A CSF circulante para obter uma concentração de 0,2 milimolar de glutamato enjaulado. Em seguida, transfira uma fatia cerebral para a câmara de registro.

Execute o sistema de imagem para verificar a qualidade do corte e localizar anatomicamente a área somatossensorial primária. Em seguida, fixe o corte com um anel de platina com fios personalizado, tomando cuidado para não colocar a fixação sobre a região cerebral destinada à gravação. Visualize as células com uma objetiva de 60 x com base na visualização da expressão de GFP em um microscópio fluorescente DIC.

Identifique e selecione os tipos de células inibitórias. Observe que a gravação será realizada sob controle visual auxiliado por DIC infravermelho. A monitorização por vídeo e a alternância entre os modos DIC e fluorescente são necessárias para confirmar a localização da célula GFP enquanto o eletrodo é posicionado sobre a célula-alvo.

Utilizando a técnica convencional de patch clamping. Primeiro, aplique pressão positiva ao eletrodo. Mova-o próximo à superfície da célula para estabelecer uma depressão visível na membrana da célula-alvo.

Em seguida, aplique pressão negativa rapidamente para formar um selo giga e romper a célula, monitorando as respostas à injeção de corrente no monitor de vídeo. Após a ruptura, obtenha imagens do interneurônio gravado que expressa GFP com ampliação de 60x nos modos DIC e fluorescente para verificação em tempo real. Antes de coletar os dados de fotoestimulação, injete pulsos de corrente hiperpolarizantes e despolarizantes para examinar as propriedades eletrofisiológicas básicas de cada célula.

Uma vez alcançado o registro estável de célula inteira com boa resistência de acesso, que geralmente é inferior a 20 megaohms, mude a objetiva do microscópio de 60x para 4x de ampliação para a fotoestimulação com varredura a laser, adquira uma imagem do corte em 4x de ampliação e utilize-a para orientar e registrar os locais de fotoestimulação. Defina os parâmetros de fotoestimulação e aquisição de dados ativando o módulo de comutação de configuração do phys. Utilize um pulso a laser de um milissegundo com cerca de 20 miliwatts e um intervalo de estímulo de um segundo.

Para o mapeamento com estimulação fotônica, adquira traços de dados de um segundo amostrados a 10 quilohertz. Em seguida, carregue a imagem da fatia x4 no módulo mapeador do phys. Defina a localização do soma e configure os sítios de estimulação fotônica em um padrão de 16 por 16 com 80 micrômetros por 80 micrômetros.

Espaçamento ao redor da localização da célula, que abrange todas as camadas corticais. Em seguida, mapeie o perfil de excitação do neurônio registrado examinando os locais de disparo em resposta à fotoestimulação no modo de fixação de corrente. Nosso software de fácil utilização, com recursos de exibição em tempo real, facilita os experimentos de mapeamento.

Em seguida, mapeie as conexões do circuito excitatório local detectando as correntes pós-sinápticas excitatórias na célula gravada. Com a varredura a laser em diferentes localizações, mantenha a célula em −70 milivolts no modo de fixação de voltagem para detectar correntes excitatórias entrantes. Em seguida, repita os mapas de correntes pós-sinápticas excitatórias duas a três vezes, com o padrão de fotoestimulação rotacionado ou invertido. Para mapear as conexões do circuito inibitório local, detecte as correntes pós-sinápticas inibitórias na célula gravada.

Mantenha a célula próximo a zero milivolts neste caso, menos 15 milivolts no modo de fixação de voltagem, a fim de detectar correntes inibitórias para fora. Após concluir todos os ensaios fisiológicos, remova suavemente o eletrodo da célula gravada. Remova a fatia cerebral da câmara, depois fixe-a em paraformaldeído 4% durante a noite e marque as células gravadas contra biotina.

Neste experimento, a combinação da expressão de GFP, da eletrofisiologia intrínseca e das características morfológicas é utilizada para classificar os neurônios inibitórios. Abaixo estão o exemplo e um mapa de dados brutos para ilustrar a fotoestimulação com varredura a laser, que permite o mapeamento extensivo das conexões locais do circuito cortical ao neurônio inibitório registrado. Aqui estão os exemplos dos mapas quantitativos de entrada codificados por cores derivados dos traços brutos mostrados anteriormente na Figura D. As amplitudes dos eventos sinápticos detectados no interneurônio registrado são codificadas por cores e sobrepostas topograficamente sobre as localizações da fotoestimulação.

A localização do corpo celular é indicada pelo círculo aberto vermelho na barra de escala. As cores quentes indicam entradas sinápticas fortes e as cores frias indicam conectividade fraca ou inexistente com a célula-alvo. De forma semelhante, a figura E apresenta o número de eventos sinápticos por local de fotoativação amostrado no neurônio registrado.

A Figura F demonstra o tempo de início do primeiro evento sináptico detectado na célula gravada após a fotoestimulação na barra de escala. As cores quentes indicam entrada curta, latência, e cores mais frias indicam latências sinápticas mais longas. Assim, a LSPS permite a construção de mapas detalhados da posição, intensidade, latência e número de entradas que atingem tipos específicos de neurônios inibitórios.

Bem, ao realizar este procedimento, é importante ser paciente, manter condições experimentais limpas e manipular os neurônios de forma eficaz e muito cuidadosa ao alternar do objeto de alta magnificação para o de baixa magnificação. Em seguida, utilize bem o software de análise.