A contração da artéria mesentérica e Estudos Relaxamento Usando Miografia Fio Automated
22 de setembro de 2011
Um método automatizado para medições Miografia vigor em artérias mesentéricas isoladas é descrito. Ele emprega um Mulvany-Halpern Auto Myograph fio duplo 510A para determinar as respostas à fenilefrina e cálcio extracelular. O método permite a determinação consistente de respostas isométrica aos agonistas em pequenos vasos de diâmetros de 60 - 300 mm, de forma independente.
Este procedimento utiliza ratos sensíveis e resistentes ao sal para comparar a reatividade das artérias de resistência mesentéricas sob tensão de fenilefrina em relação ao cálcio extracelular. Isso é realizado primeiramente isolando o arco mesentérico dos animais e dissecando os ramos arteriais de resistência. A seguir, o primeiro de dois fios de aço inoxidável é passado através de um segmento curto da artéria dissecada e o vaso é montado na câmara de grafia.
Em seguida, o segundo fio de aço inoxidável é passado pelo lúmen do vaso paralelamente ao primeiro fio. Depois, o vaso montado é esticado até uma circunferência interna normalizada. O passo final do procedimento é reativar o vaso, estimulando-o repetidamente com fenilefrina e relaxando-o com aplicações cumulativas de cálcio.
Por fim, os resultados mostram alterações na tensão do vaso, as quais podem ser convertidas em uma curva de resposta ao cálcio e utilizadas para determinar valores de CE 50. Para comparação. Tivemos inicialmente a ideia de usar este método quando descobrimos que a rede nev de baterias Masonry de rato expressava um receptor de cálcio sensível a gpro cobre.
Isso pode ser estudado da mesma forma que os receptores AIC amargos, que são ativados por um agonista. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque as camadas de endotélio e músculo liso são pequenas. Os vasos são facilmente danificados.
Se isso ocorrer, as propriedades mecânicas desses vasos podem ser comprometidas. Para começar, prepare a área de trabalho e os instrumentos cirúrgicos. Coloque um animal anestesiado em decúbito dorsal e limpe o abdômen com álcool.
Após realizar uma laparotomia mediana, use tesoura para remover cerca de 85 centímetros de intestino, incluindo a artéria mesentérica superior. Corte a extremidade proximal próxima ao piloro e a extremidade distal perto da junção íleo-cecal. Coloque o segmento ressecado em uma placa de Petri revestida contendo solução salina fisiológica ou SSF à temperatura ambiente.
Fixe a extremidade proximal do intestino para a direita e, em seguida, fixe o restante do intestino em sentido anti-horário. Em seguida, dissecar um segmento da artéria mesentérica contendo os ramos dois e três e um pedaço do intestino a partir da extremidade proximal. Identifique o ponto de bifurcação em forma de V da artéria mesentérica e dissecá-lo separando-o da veia.
Use pinças para remover suavemente o tecido adiposo e conjuntivo, evitando o contato direto com a artéria. Para iniciar o preparo do vaso, corte dois segmentos da artéria com cerca de dois milímetros de comprimento. A ponta de um fio de aço inoxidável livre de tungstênio, com quatro centímetros de comprimento e 40 micrômetros de espessura, pode ser usada para abrir a luz da artéria.
Em seguida, use pinças finas para inserir o fio no lúmen de cada artéria. Tendo cuidado para não danificar o endotélio, preencha a câmara do enxerto miográfico com PSS a 37 graus Celsius. Use pinças para transferir o segmento vascular com fios para a câmara.
Em seguida, transfira o segmento vascular proximal ressecado para a câmara do miógrafo e puxe a extremidade ao longo do fio para introduzi-lo no vaso. Evite esticar o vaso. Fixe a extremidade próxima do fio no sentido anti-horário sob o parafuso fixador próximo na mandíbula direita conectada ao micrômetro.
Segure a extremidade livre do fio com pinça e fixe-a no sentido horário sob o parafuso distal da mandíbula direita; certifique-se de que o segmento do vaso ao longo do fio esteja posicionado na abertura entre as mandíbulas, sem fazer contato com a própria mandíbula. Parafuse as mandíbulas para afastá-las. Alinhe o segundo fio paralelamente ao vaso e insira-o na extremidade distal da luz.
Insira suavemente o fio através da luz do segmento do vaso em um único movimento, utilizando o fio já montado como guia. Segure o fio a cerca de um centímetro do vaso para evitar esticá-lo durante a manobra e evite tocar o endotélio. Parafuse as mandíbulas juntas e certifique-se de que o segundo fio de montagem passe sob o primeiro, que está fixado no lado direito.
Maxila fixe a extremidade próxima do segundo fio no sentido horário sob o parafuso de fixação próximo da maxila esquerda conectada ao transdutor. Fixe a extremidade distante do fio sob o parafuso de fixação da maxila esquerda e aperte para esticar o fio. Após a montagem estar completa, aguarde 30 minutos para a equilibração a 37 graus Celsius.
Após a equilibração, o motor é redefinido a partir do menu de montagem e é iniciado o procedimento de normalização, que estica o vaso até uma circunferência interna normalizada. Para começar, abra o menu de normalização e defina a pressão transmural alvo em 13,3 quilopascals. Em seguida, defina a duração de cada etapa da normalização para 60 segundos.
A proporção entre IC um e IC 100 deve ser igual a 0,9 e a calibração de IP deve ser ajustada em dois deltas estrela. Meça o comprimento da artéria mesentérica montada utilizando as leituras da ocular do microscópio quando as linhas finas estiverem sobre as extremidades e os neurônios do segmento do vaso. Após a normalização, os vasos são reativados mediante um protocolo padrão que consiste em uma série de estimulações e períodos de lavagem.
Primeiro, substitua a tampa da câmara miográfica e inicie a aeração com 95%ar e 5%dióxido de carbono. Encha a câmara com PSS fresco contendo 100 micromolar de ácido ascórbico. Contraia o vaso com cinco micromolar de fenilefrina ou PE por cinco minutos e lave quatro vezes com tampão PSS. Após a última lavagem, reabra a câmara com PSS e aguarde três minutos antes de reabastecer a câmara com PSS e contrair com PE. Como mostrado anteriormente, a artéria está agora pronta para o experimento.
Meça o relaxamento de vasos contraídos pela adição cumulativa de concentrações crescentes de cloreto de cálcio. Esta tabela mostra que as tensões basais após a aplicação de fenilefrina variaram entre ratos Wistar DS ou Doll sensíveis ao sal e ratos DR ou Doll resistentes ao sal. Este traçado de um rato Wistar mostra o relaxamento de artérias contraídas por PE mediante adições cumulativas de cálcio, com relaxamento severamente comprometido em tecidos de ratos DS em comparação com ratos Wistar e em comparação com ratos DR. Como visto aqui, as diferenças na sensibilidade ao cálcio podem ser observadas nas curvas de resposta ao cálcio e novamente ao calcular os valores de EC 50.
Por fim, ratos DS apresentam uma redução na expressão do receptor sensor de cálcio nas artérias em comparação com ratos Dr. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas horas, se executada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como comparar a reatividade vascular de pequenas artérias mesentéricas a compostos exógenos sob condições isométricas.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método automatizado de miografia para medir a força em artérias mesentéricas isoladas. A técnica utiliza um miógrafo automático de dois fios Mulvany-Halpern 510A para avaliar as respostas à fenilefrina e ao cálcio extracelular, permitindo medições consistentes de resposta isométrica em vasos pequenos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Vascular
- Técnicas de Miorrefia
Antecedentes
- As artérias mesentéricas desempenham um papel crucial na regulação do fluxo sanguíneo.
- Compreender sua reatividade é importante para a pesquisa cardiovascular.
- A fenilefrina é um agonista comum usado para estudar respostas vasculares.
- Os níveis de cálcio são críticos para a contração do músculo liso vascular.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para medir a força em artérias mesentéricas pequenas.
- Comparar a reatividade de ratos sensíveis ao sal e resistentes ao sal.
- Avaliar os efeitos da fenilefrina e do cálcio sobre as respostas vasculares.
Métodos Utilizados
- Isolamento do arco mesentérico de ratos.
- Dissecação de ramos arteriais de resistência.
- Montagem de artérias em uma câmara de miógrafo utilizando fios de aço inoxidável.
- Aplicação de fenilefrina e cálcio para avaliar a reatividade vascular.
Resultados Principais
- Medições consistentes de força foram obtidas em artérias isoladas.
- Foram observadas diferenças na reatividade entre ratos sensíveis e resistentes ao sal.
- A fenilefrina induziu efetivamente tensão nas artérias.
- A aplicação de cálcio resultou no relaxamento dos vasos.
Conclusões
- O método automatizado de miografia fornece uma abordagem confiável para o estudo das respostas vasculares.
- Essa técnica pode aprimorar a compreensão da função da artéria mesentérica.
- Os achados podem ter implicações para a pesquisa de doenças cardiovasculares.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A miografia automatizada com fios de artérias mesentéricas permite uma avaliação precisa e quantitativa da reatividade vascular sob condições isométricas, apoiando a validação precoce de alvos na pesquisa cardiovascular. Esta abordagem fornece confiança preditiva para a redução de riscos mecanicistas de alvos vasculares e orienta decisões de portfólio em programas de hipertensão e disfunção vascular. A reprodutibilidade do método e suas saídas quantitativas facilitam a comparação robusta dos efeitos de compostos e modelos genéticos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da função de receptores e das vias de sinalização do músculo liso vascular.
- Apóia a desmistificação biológica ao quantificar as respostas contráteis e de relaxamento a agonistas e antagonistas.
- Facilita a confiança preditiva na seleção de alvos para indicações vasculares e cardiovasculares.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara sistemas vasculares validados ex vivo para triagem de compostos e estudos mecanicistas.
- Fornece medidas padronizadas, reprodutíveis e quantitativas de tensão para o desenvolvimento de ensaios.
- Permite comparação paralela de agentes farmacológicos e modelos genéticos em formato escalável.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha dados de reatividade vascular ex vivo com modelos relevantes para a doença de hipertensão e disfunção vascular.
- Apóia a identificação de biomarcadores translacionais ao associar a expressão de receptores com resultados funcionais.
- Oferece continuidade desde a descoberta inicial até a validação pré-clínica de alvos vasculares.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método automatizado de miografia se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico, conectando estudos mecanicistas iniciais com pesquisas translacionais em biologia vascular.
- Biologia da Descoberta: Quantifica a contratilidade e o relaxamento dos vasos para testar hipóteses sobre a função de receptores e sinalização.
- Triagem: Fornece preparações de vasos prontas para ensaios e reprodutíveis para avaliação de compostos e classificação de potência.
- Análises: Gera valores de CE50 e curvas de resposta para comparação estatística robusta entre condições e modelos.
- Pesquisa Translacional: Relaciona dados funcionais ex vivo com modelos de doenças in vivo e estratégias de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma padronizada para investigação contínua de alvos e vias vasculares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos vasculares.
- Valor Operacional: Fornece ensaios padronizados, reprodutíveis e escalonáveis de reatividade vascular.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avançar/não avançar e reduz riscos biológicos em fases tardias nos portfólios cardiovasculares.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos vasculares e compostos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação vascular e manipulação de tecidos ex vivo.
- Necessita de acesso a instrumentação automatizada de miografia com fio e software analítico.
- Exige padronização rigorosa entre equipes nos procedimentos de montagem e normalização dos vasos.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes tipos de vasos ou modelos de doenças.
- O pequeno tamanho dos vasos aumenta o risco de danos mecânicos, afetando a confiabilidade do ensaio.
