Perfil de tensão-gated Expressão mRNA canais de potássio em neurônios da substância negra usando uma única célula RT-PCR Técnicas

O objetivo geral deste procedimento é detectar RNAs mensageiros em neurônios individuais. Isso é realizado por meio de grampo de patch e registro de neurônios individuais, seguido da aspiração completa do citoplasma de cada neurônio registrado, contendo o mRNA e o citoplasma. O DNAc é produzido e amplificado por PCR.

Em última análise, mRNAs específicos para receptores, canais iônicos e enzimas podem ser detectados por meio de um sistema convencional de imagem em gel. Meu nome é, trabalho no Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Tennessee. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades porque a quantidade de RNAm em um único neurônio é extremamente pequena e facilmente perdida.

Inicie este protocolo utilizando um vibrátomo para cortar fatias coronais do cérebro com 300 micrômetros de espessura, contendo a parte média rostral da substância negra. Os cérebros podem ser isolados de ratos Sprague-Dawley com idade entre 15 e 40 dias. O procedimento de corte das fatias é realizado sob gelo em uma solução de corte com alta concentração de sacarose, oxigenada com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono, e com pH de 7,4. Incube as fatias em fluido cerebroespinhal artificial e borbulhado com uma mistura gasosa de 5% de dióxido de carbono e 95% de oxigênio.

Mantenha a temperatura a 34 graus Celsius e deixe as fatias nesse local por 45 minutos. Em seguida, mantenha as fatias cerebrais à temperatura ambiente até o registro. Comece transferindo uma fatia cerebral para uma câmara de gravação de patch clamp.

Perfundido continuamente com fluido cerebroespinhal artificial oxigenado a 32 graus Celsius. Preencha as pipetas de patch com solução intracelular autoclavada preparada com água livre de DNAs e RNAs. Abaixe uma pipeta carregada na câmara.

Verifique se a resistência está entre dois e três megaohms. Primeiro, localize a substância negra pela sua localização anatômica distinta. Em seguida, utilizando óptica namar e uma objetiva de 60x, selecione células grandes na SNC e SNR para gravação.

Essas são possíveis neurônios dopaminérgicos ou GABAérgicos, sem hesitação. Utilize uma configuração convencional de célula inteira com selo giga para realizar o registro em regime de corrente e em regime de tensão. Esses registros geralmente devem ser realizados em menos de cinco minutos para minimizar a degradação de mRNA.

Em cerca de um minuto, é possível obter impressões digitais eletrofisiológicas para os neurônios de interesse registrando apenas suas propriedades de membrana e de disparo. Após obter dados de um neurônio de interesse, use sucção suave pela boca para aspirar o citoplasma. O selo apertado não deve ser rompido, caso contrário.

Detritos extracelulares, incluindo mRNA, podem ser sugados para dentro da pipeta de patch e contaminar o conteúdo celular. Expulse o conteúdo celular para um tubo PCR de 0,2 mililitro quebrando a ponta da pipeta e aplicando uma leve pressão positiva. Ao finalizar, coloque imediatamente o tubo em um congelador a menos 20 para descartar contaminação por detritos extracelulares que possam conter RNMs.

Prepare um controle negativo coletando o conteúdo de uma pipeta de patch posicionada no tecido sem aplicar qualquer aspiração. Após coletar o conteúdo celular de entre 10 a 20 neurônios, inicie imediatamente a reação de transcrição reversa. Para minimizar a degradação dos RNAm, comece digerindo qualquer DNA genômico contaminante com DNAses por cinco minutos a 25 graus Celsius.

Esta etapa é crítica para reduzir potenciais falsos positivos e não deve ser ignorada. Em seguida, inative o DNA com 1,2 microlitro de EDTA 25 milimolar e incube as amostras a 70 graus Celsius por cinco minutos. Agora, utilize um kit comercialmente disponível para sintetizar o cDNA a fim de verificar se o DNA genômico foi completamente removido.

Realize uma reação controle de cada amostra sem transcriptase reversa. Enquanto todos os outros componentes da reação permanecem iguais. Armazene os produtos a menos 20 graus Celsius até que sejam necessários para o desenho da PCR.

Primos de acordo com as sequências no GenBank, sempre que possível, faça reparos primários com inserção de T para ajudar a detectar contaminação por DNA genômico. Para verificar a eficácia dos pares de primers, teste-os em cDNA de cérebro inteiro na primeira etapa. Amplifique por PCR cinco microlitros dos 30 microlitros de cDNA por 35 ciclos utilizando um protocolo padrão de termociclagem.

Para a segunda etapa, amplifique por PCR um microlitro do produto da PCR da primeira etapa com o mesmo reparo de iniciador e utilize um perfil de ciclagem ligeiramente modificado. Em seguida, separe os produtos em um gel de agarose a 2,5% e visualize-os usando brometo de AUM ou gel verde. Sob luz UV, recorte as bandas de DNA positivas e sequencie-as utilizando um kit comercialmente disponível para coletar o DNA.

As características eletrofisiológicas dos neurônios na substância negra, pars compacta, e pars reticulata foram comparadas. Os neurônios GABAérgicos da SNR exibiram maior frequência, com disparos espontâneos em torno de 10 hertz. Os potenciais de ação tinham duração de base em torno de um milissegundo após injeção de corrente hiperpolarizante.

Os neurônios GABAérgicos da SNR exibiram uma resposta SAG sutil, indicando uma corrente fracamente ativada. Em contraste, os neurônios dopaminérgicos nigrais exibiram potenciais de ação espontâneos de baixa frequência com duração de base de cerca de três milissegundos. Os neurônios dopaminérgicos também mostraram um SAG acentuado em resposta à hiperpolarização, indicando uma forte expressão da corrente IH em neurônios GABAérgicos da SNR, mas não em neurônios dopaminérgicos.

A R-T-P-C-R de célula única detectou mRNA para a descarboxilase do ácido glutâmico um, uma enzima chave na síntese de GABA. Em contraste, um neurônio dopaminérgico SNC e SNR identificado, mas não em neurônios GABAérgicos. A R-T-P-C-R de célula única detectou mRNA para a tirosina hidroxilase, uma enzima chave na síntese de dopamina.

Em seguida, a R-T-P-C-R de única célula foi utilizada para analisar a expressão das subunidades do canal KV3 ativadas por voltagem, as quais variam as propriedades dos canais de potássio dependentes de voltagem. No exemplo de neurônio GABA do SNR, os RNAm para KV 3.1, 3.2, 3.3 e 3.4 foram detectados apenas em um neurônio exemplo do SNRDA. KV 3.2, 3.3 e 3.4 foram detectados nos dados agrupados.

KV 3.1 foi detectado com mais frequência em neurônios GABAérgicos da SNR do que em neurônios dopaminérgicos nigrais, indicando um nível mais alto de expressão de KV 3.1 nos neurônios GABA da SNR de Viking rápido. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar luvas e manter as ferramentas livres de contaminação após o seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de neurociência explorarem a expressão e a função de receptores e canais iônicos no sistema nervoso.