Isolamento & Caracterização da Hoechst ^Baixa CD45 ^Negativo Mouse Células-Tronco Mesenquimais de pulmão

Este vídeo demonstra um protocolo para o isolamento de células-tronco mesenquimais pulmonares de baixa expressão de CD45 negativo do hospedeiro. As células-tronco mesenquimais residentes no tecido, ou CSMs, são importantes reguladoras da reparação ou regeneração tecidual, fibrose, inflamação e angiogênese. Primeiro, os pulmões são dissecados de um camundongo sacrificado.

O tecido pulmonar é digerido para obter uma suspensão de células únicas. As células são coradas com corante hoax e CD 45 e separadas por citometria de fluxo para obter MSCs pulmonares CD 45 negativas e com baixa expressão de CD 45 de origem hospedeira. Os MSCs pulmonares são então expandidos em cultura e um ensaio de formação de colônias é realizado para avaliar a capacidade de diferenciação dos MSCs.

Estudos adicionais podem então ser realizados para examinar o papel das MSCs durante a homeostase tecidual e doenças. O método que apresentamos aqui pode ser usado para isolar células-tronco mesenquimais pulmonares de camundongo ou humano e pode ser aplicado a esse estudo de doenças pulmonares, como fibrose pulmonar, hipertensão pulmonar e DPOC. Geralmente, indivíduos novos nesse método enfrentarão dificuldades devido à variedade de métodos disponíveis para o preparo de tecidos, bem como para a configuração do citômetro de fluxo, controles apropriados e análise.

A demonstração visual deste método é essencial, pois é difícil descrever adequadamente a técnica correta para picar e digerir o tecido pulmonar visando à viabilidade ótima das células apenas com palavras. Além disso, a configuração e as análises no instrumento de citometria de fluxo são melhor transmitidas por meio de demonstração. Inicie este protocolo removendo os pulmões que serão utilizados para obter as células-tronco mesenquimais de um camundongo adulto sacrificado.

Use uma pequena tesoura afiada para cortar a caixa torácica lateralmente em cada lado do camundongo. Abra a cavidade torácica e, em seguida, remova o diafragma. Insira uma seringa de 10 mililitros com uma agulha de 20 e meia polegadas no ventrículo cardíaco direito e pressione suavemente o êmbolo para perfundir com três a cinco mililitros de PBS, removendo o sangue dos pulmões.

Em seguida, usando tesoura, corte a traqueia e os grandes brônquios e descarte-os. Então, com pinça, segure os pequenos lobos pulmonares brancos e coloque-os em uma placa de Petri contendo solução salina tamponada com Hank ou HBSS.

Em seguida, remova o coração e separe os lobos pulmonares. Repita este processo para todos os camundongos do estudo. Transfira os lobos pulmonares para a tampa da placa.

Umedeça o tecido com quantidade suficiente de HBSS apenas para evitar que seque. Em seguida, usando um bisturi descartável, pique os lobos pulmonares para obter medula óssea a ser usada como controle de sustentação para citometria de fluxo. Use um par de tesouras afiadas para cortar no tornozelo e na parte superior do fêmur.

Coloque o membro em uma nova placa de Petri. Em seguida, corte o joelho, deixando um segmento linear do fêmur e um segundo segmento contendo a tíbia e a fíbula. Usando pinça, remova o músculo para expor a tíbia, a fíbula e o fêmur.

Agora, pegue uma seringa de cinco mililitros com uma agulha de 26 e meia polegadas e insira a agulha na abertura da medula óssea. Em uma das extremidades da tíbia, segure o osso com a outra extremidade direcionada para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 15 mililitros de HBSS e pressione o êmbolo para dispensar o HBSS e lavar a medula óssea para dentro do tubo. Repita este processo com a fíbula e o fêmur.

Marque a medula óssea com o corante 3 3 3 4 2 do hospedeiro em uma concentração final de cinco microgramas por mililitro em DMEM com alto teor de glicose suplementado. Em seguida, será gerada uma suspensão de células únicas do tecido pulmonar a partir do tecido isolado. Coloque cada pulmão em um tubo contendo Worthington 0,2% pré-aquecido.

Colagenase tipo II preparada em HBSS estéril, em seguida imergir o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius e incubar por 30 minutos. Após a incubação, usar a pipeta de 10 mililitros para triturar a amostra até que o digestivo flua facilmente pela pipeta. Aproximadamente 10 repetições, incubar por mais 15 minutos a 37 graus Celsius para completar a digestão do tecido.

Após a conclusão da digestão, dilua a suspensão celular com HBSS e use uma pipeta de cinco mililitros para tentar novamente dispersar quaisquer fragmentos residuais de tecido. Em seguida, para remover os fragmentos de tecido não digeridos, despeje a suspensão através de um filtro celular de 70 micrometros em um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione a suspensão pouco a pouco para permitir que a amostra escoe através do filtro celular.

Se fragmentos de tecido não digeridos bloquearem completamente o fluxo da suspensão celular, despeje por um novo filtro celular em um novo tubo. Centrifugue a suspensão celular por 10 minutos a 450 RCF.

Após a centrifugação, decante o sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet celular em tampão de lise de eritrócitos à temperatura ambiente. Incube à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, adicione um volume igual de HBSS para inativar o tampão de lise.

Despeje a suspensão celular em um filtro de células de 40 micrometros para remover detritos e agregados celulares, coletando o fluxo passante em um novo tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, utilizando um hemocitômetro, determine o número de células para as amostras de pulmão e medula óssea. Registre a concentração e o volume total da suspensão celular.

Em seguida, pelletize a suspensão de células pulmonares únicas por centrifugação a 450 RCF durante 10 minutos. Para manter as células viáveis, reconstitua simultaneamente as células pulmonares e da medula óssea. Dez elevado a seis células por mililitro em DMEM de alta glicose suplementado e pré-aquecido.

Para corar o DNA, adicione o corante HOAXED 3 3 3 4 2 até uma concentração final de cinco microgramas por litro. Em seguida, homogeneíze as células por inversão suave e incube em banho-maria a 37 graus Celsius por exatamente 90 minutos. Então, centrifugue por 10 minutos a 450 Gs a quatro graus Celsius após a centrifugação.

Prossiga com a coloração do tecido pulmonar e da medula óssea com anti-CD45 e iodeto de propídio, em preparação para análise por citometria de fluxo. Após as células terem sido coradas, armazene os tubos no gelo, protegidos da luz, até que a análise por citometria de fluxo seja realizada. Prepare-se para a citometria de fluxo garantindo que os lasers do instrumento estejam alinhados e que ele esteja configurado para separação celular.

O instrumento utilizado deve ser equipado com lasers azul de 488 nanômetros, vermelho de 635 nanômetros e UV de 350 a 355 nanômetros, com dois detectores no percurso do laser UV com filtros azul 45/65 e vermelho 675/50. Além disso, o detector UV-vermelho deve ter alta sensibilidade para o sinal vermelho, e o instrumento deve estar equipado com unidade refrigeradora para manter a amostra a 10 graus Celsius. No software do instrumento, configure gráficos de histograma para exibir dispersão para frente linear versus dispersão lateral e um gráfico de discriminação de dupletos apropriado para o instrumento.

Um gráfico de histograma de PI utilizando um sinal logarítmico, um gráfico de dispersão de vermelho versus azul utilizando sinais lineares e um gráfico de histograma de CD45 APC utilizando um sinal logarítmico. Quando o instrumento estiver pronto, coloque a amostra de medula óssea corada na porta de carregamento do instrumento. Esta amostra é utilizada como controle de coloração e de configuração do instrumento.

Inicie a coleta de eventos e ajuste os sinais lineares de dispersão direta. Para visualizar claramente a população celular, as células devem situar-se aproximadamente no centro inferior do gráfico de dispersão direta, com este no eixo x. Como o corante nuclear PI é permeável à membrana IMP, será excluído das células vivas.

Desenhe uma região de análise na população de células mortas positivas para PI no histograma de PI. Instrua o software do instrumento a colorir as células mortas com esta cor vermelha.

É útil utilizar a coloração com ventilação de células mortas como guia para identificar a população de hospedeiro G zero G um. A coloração com PI também é excitada pelo laser UV e a maioria das células mortas deve estar fora da escala. No lado direito do gráfico de fluorescência vermelha versus azul falsificada, a população G zero G um da medula óssea deve ser observada como um agrupamento compacto de eventos no gráfico de fluorescência vermelha versus azul falsificada.

Ajuste as tensões do detector para posicionar o agrupamento G0G1 no canto superior direito central do gráfico. Uma porção da fase S e todo o G2 do ciclo celular podem estar fora da escala. No canto superior direito do gráfico de cor vermelha versus azul manipulado, a população lateral com baixa intensidade será vista estendendo-se do lado esquerdo do agrupamento G0G1 até o canto inferior esquerdo do gráfico.

Agora desenhe um quadrante ao redor do agrupamento celular na dispersão FSC versus SSC. Represente graficamente a população de células únicas identificada no gráfico de duplos e as células viáveis no histograma de PI. Em seguida, configure o gráfico de controle para exibir apenas essas populações selecionadas.

Após definir o enquadramento no gráfico do hospedeiro, desenhe uma região ao redor da população lateral. Atribua esta região como um enquadramento ao histograma de CD 45 A PC, juntamente com os enquadramentos de células únicas pela dispersão lateral e de células viáveis. Agora que o sistema está configurado, remova a amostra do porto de carregamento e coloque a amostra de pulmão no porto de carregamento.

As configurações do instrumento não precisam ser ajustadas novamente para esta amostra. Comece a coletar eventos no gráfico de vermelho versus azul. O agrupamento G zero G um para a amostra de pulmão geralmente aparece mais alongado na direção do eixo x e assemelha-se ao símbolo til em um teclado.

A posição do gradiente de passagem da população lateral deve ser semelhante à definida para a amostra de medula óssea. Pequenos ajustes para cima ou para baixo podem ser necessários para garantir uma boa resolução da população lateral. Mantenha uma diferença de pressão baixa durante a separação, assegurando-se de que a válvula de fluxo da amostra não seja aberta em excesso.

Em seguida, para isolar as CMM, coloque uma placa de coleta de 96 poços na câmara de separação e configure os gates de separação no histograma de CD45 A PC para separar as populações positiva e negativa. Por fim, colete as células como uma população mista em um tubo ou células individuais para isolar clones em uma placa de 96 poços. Após a coleta das CMM pulmonares por meio de separação celular, as células são semeadas em placas de 30 milímetros utilizando MEM-A suplementado com 20% de FBS. Inicialmente, as células separadas aparecem pequenas, arredondadas e brilhantes após aproximadamente duas a três semanas.

Colônias com fenótipo mesenquimal tornam-se evidentes e a proliferação é mais aparente para cada preparação celular. Avalie a capacidade dos MSC pulmonares de se diferenciarem em linhagens mesenquimais tradicionais de osteoblastos, adipócitos e condrócitos, bem como sua expressão de marcadores mesenquimais aceitos na superfície celular. Realize análise de bandagem citogenética para confirmar a ausência de anormalidades cromossômicas grosseiras.

Após o isolamento por citometria de fluxo e a geração de clones de células individuais, realiza-se um ensaio de formação de colônias para caracterizar as células MSC e suas capacidades de diferenciação. Inicie com células diluídas a três vezes 10 à quarta células por mililitro. Em meio cul incompleto em placas de 100 milímetros, realize diluições seriadas de seis vezes 10 à quarta, três vezes 10 à quarta, 1,5 vezes 10 à quarta e 0,75 vezes 10 à quarta células por placa em 10 mililitros de meio, em triplicata.

Em seguida, coloque as placas no incubador após 10 dias de cultivo, desprenda o meio e lave as células com PBS. Em seguida, fixe-as adicionando metanol a 100% durante cinco minutos à temperatura ambiente. Após cinco minutos, desprenda o metanol.

Em seguida, para detectar a formação de colônias, adicione gza a 0,4% peso por volume, diluído na proporção de 1 para 20 com água ionizada, e incube por 10 a 15 minutos. Em seguida, descarte o corante e lave com água ionizada. Deixe as amostras secarem ao ar e quantifique o número de colônias contendo mais de 25 células por colônia utilizando um microscópio invertido ou visualização.

As colônias são grandes e compostas por algumas centenas de células, como mostrado aqui, e exibem um fenótipo mesenquimal. As CMM foram isoladas conforme mostrado neste vídeo e semeadas em placas de 96 poços para simular o crescimento. Células apresentadoras de antígeno marcadas com CFSE e arrestadas foram então adicionadas às CMM pulmonares.

A proliferação de MSCs isoladas foi então medida pela diminuição da intensidade média de fluorescência de CFSE em comparação com o fundo, que consistia em linfócitos T marcados com CFSE isoladamente, conforme mostrado nesta figura, na ausência de SC pulmonar e na presença de células apresentadoras de antígeno, A PC com e sem albumina O, linfócitos T efetores CD40 positivos demonstram uma diminuição na intensidade de CFSE, o que indica proliferação, circulada em vermelho. A intensidade de fluorescência de CFSE na membrana dos linfócitos T diminui de forma equimétrica a cada divisão celular, ou seja, pela metade a cada divisão, na presença de M-S-C-A-P-C pulmonar com e sem OVA, linfócitos T efetores CD40 positivos não demonstram mudança significativa na intensidade de CFSE, o que indica ausência de proliferação após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área da biologia de células-tronco pulmonares explorarem o papel das células-tronco mesenquimais em doenças pulmonares, como hipertensão arterial pulmonar e fibrose pulmonar.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente cinco horas, seguindo este procedimento. Outros métodos, como ensaios de diferenciação, podem ser realizados para responder a questões adicionais, incluindo se as células-tronco mesenquimais pulmonares putativas exibem diferenciação multilinial apropriada, com potencial para os tecidos ósseo, adiposo e cartilaginoso.