Alto rendimento Assay Sacarificação para materiais lignocelulósicos

Olá, sou Kara Ted, sou Leo. Vamos lá. E sou Simon McQueen Mason.

A digestibilidade da biomassa vegetal é um tema de grande interesse no momento atual. Isso porque há uma grande quantidade de açúcares presos nos polissacarídeos das paredes celulares vegetais que compõem essa biomassa, e se conseguirmos liberar esses açúcares de forma utilizável, poderemos fermentá-los para produzir todo tipo de produto, como combustíveis e produtos químicos. Infelizmente, esses materiais são extremamente difíceis de digerir, e obter uma melhor compreensão do que controla essa digestibilidade é uma questão de certa urgência.

Para poder utilizar material vegetal na produção de grupos renováveis, precisamos ser capazes de medir o potencial de fificação nessas plantas. Aqui na Universidade de York, estamos analisando grandes populações de material vegetal para determinar seu potencial de fificação. Fificação é o processo de quebra de carboidratos complexos em seus componentes de monossacarídeos para produzir substâncias químicas valiosas por meio de diferentes processos industriais.

Para medir o potencial de sacarificação, reproduzimos processos industriais em escala microscópica, submetendo a biomassa a um pré-tratamento e à hidrólise enzimática para determinar os açúcares liberados. Isso identifica variedades interessantes em genótipos. O sistema de alto rendimento funciona em formato de placa de seis poços IG.

Condições brandas de hidrólise são utilizadas para expor diferenças sutis entre genótipos, sendo também suficientemente flexíveis para suportar diferentes materiais de substrato, bem como para avaliar diferentes enzimas. O método que utilizamos envolve a preparação do material vegetal na forma de pó, que é então pré-tratado com um ácido ou alcalino diluído a 90 graus por 20 minutos. Em seguida, realiza-se uma digestão enzimática utilizando uma mistura comercial de celulase a 50 graus por oito horas.

Por fim, utiliza-se um método MBTH para determinar a liberação de açúcares redutores. O material vegetal é colhido na forma de hastes secas, que são cortadas em segmentos de quatro milímetros. Estes são colocados em frascos de dois mililitros juntamente com três esferas metálicas de cinco milímetros.

Os frascos são individualmente rotulados com códigos de barras, que são escaneados para garantir a rastreabilidade das amostras. As amostras são carregadas nos robôs de moagem e formatação. As amostras são automaticamente moídas e misturadas para permitir a dispensação da biomassa em uma placa de 96 poços.

Os frascos são perfurados e, em seguida, reposicionados no braço robótico de forma a ficarem assentados dentro de um funil que vibra para dispensar o pó. A vibração do funil é regulada por uma balança para atingir a quantidade alvo por massa em cada poço dispensado. A biomassa é dispensada em 10 colunas das placas, reservando duas colunas para os padrões.

Ao realizar quatro repetições por amostra, carregamos 20 amostras por placa. O hidrolisado dessa placa será triplicado em placas de PCR, resultando em três placas ópticas. Dessa forma, obtemos três determinações de açúcares redutores por poço de biomassa.

Uma vez formatadas, as placas são seladas com uma manta de silicone para evitar evaporação. Quando estão prontas, são transferidas para o robô de manipulação líquida. Na manipulação líquida, o pré-tratamento, a hidrólise enzimática e a determinação dos açúcares liberados são realizados automaticamente.

A mesa de dois metros possui recipientes para os diferentes reagentes necessários, bem como espaço de armazenamento para materiais plásticos. Há incubadoras para pré-tratamento e hidrólise, além de termocicladores para a determinação de açúcares. O pré-tratamento é realizado em placa de poços profundos.

Adicionando soluções diluídas de ácido ou alcalinas ao pó de biomassa. As placas são transferidas para o bloco de aquecimento e incubadas a 90 graus por 20 minutos. Quando esta incubação for concluída, o pré-tratamento é removido mediante lavagem cinco vezes com 500 microlitros de tampão acetato.

Após a lavagem do pré-tratamento, é adicionado um coquetel enzimático. É uma mistura padrão que contém celulase e novozym 1, 8 8 numa proporção de quatro para um, numa concentração de sete FPU por poço.

As placas são incubadas por oito horas a 50 graus sob agitação. 75 microlitros do hidrolisado resultante são transferidos para uma placa de PCR. Nas colunas 11 e 12 das placas de PCR, são adicionados os padrões de glicose.

A seguir, 25 microlitros de uma molar de hidróxido de sódio são adicionados a todas as cavidades. Finalmente, 50 microlitros do reagente MBTH são pipetados na placa de PCR. A placa de poços profundos é armazenada após a conclusão da transferência do hidrolisado para a terceira placa de PCR.

Enquanto as placas de PCR são transferidas para os termocicladores e incubadas a 60 graus por 15 minutos. O passo final do processo é a transferência da mistura de reação para placas ópticas para o desenvolvimento da cor. Após a incubação, as placas de PCR são removidas do termociclador.

Adiciona-se cem microlitros de reagente oxidante à mistura reacional transferida. Para facilitar o desenvolvimento da cor, o processo de manipulação líquida é realizado quatro vezes em 24 horas, no qual a lavagem de pré-tratamento e a adição da enzima levam aproximadamente duas horas. A hidrólise enzimática leva oito horas, e a determinação do açúcar leva mais duas horas.

Enquanto a primeira placa é incubada por oito horas, a próxima placa inicia o processo. Com essa alocação de recursos robóticos, obtém-se um rendimento triplo de 80 amostras por dia para determinar a quantidade de açúcares redutores liberados. As placas ópticas são lidas a 620 nanômetros.

Os resultados obtidos são analisados para quantificar os açúcares liberados em nanomoles por miligrama por hora de reação. Então, obrigado por assistir e espero que isso inspire sua pesquisa em biocombustíveis.