Visualização da função respiratória mitocondrial usando Citocromo C Desidrogenase Oxidase / Succinato (COX / SDH) Histoquímica rotulagem dupla
23 de novembro de 2011
O citocromo c oxidase desidrogenase / sódio (COX / SDH) método duplo-rotulagem permite a visualização direta de deficiências enzimáticas mitocondriais respiratória em seções de tecido fresco congelado. Esta é uma técnica simples histoquímica e é útil na investigação de doenças mitocondriais, envelhecimento, envelhecimento e distúrbios relacionados.
O objetivo geral deste procedimento é permitir a visualização direta de deficiências enzimáticas respiratórias mitocondriais em cortes de tecido fresco congelado. Isso é realizado primeiramente coletando cortes criostáticos do órgão de interesse. O segundo passo do procedimento é realizar a histoquímica da Cox, seguida pela histoquímica da SDH.
Por fim, as seções de tecido são desidratadas, montadas e cobertas com lamínulas. Em última análise, os resultados podem mostrar a quantidade de disfunção mitocondrial por meio da intensidade da coloração azul celular. Olá. Hoje vamos falar sobre a técnica histoquímica de dupla marcação Cox-SCH.
E embora este método possa ser aplicado para estudar doenças mitocondriais, ele também pode fornecer informações sobre o envelhecimento e distúrbios relacionados à idade. Após remover o cérebro de um animal que foi sacrificado de acordo com a permissão ética, congele-o rapidamente em gelo seco. O tecido congelado pode ser armazenado a menos 80 graus Celsius, envolto em papel de alumínio, até o momento de ser seccionado.
Prepare o tecido para crioseção colocando o cérebro sobre uma pinça do criostato e rodeando-o com composto de inclusão. Coloque rapidamente a pinça no criostato e colete cortes de 14 mícrons a menos 21 graus Celsius. Derreta os cortes sobre lâminas utilizando um bloco aquecedor e, em seguida, deixe as lâminas secarem à temperatura ambiente por uma hora.
Coloque as lâminas em uma câmara de coloração com tiras de papel úmidas. Como os tempos de reação são importantes neste ensaio, recomenda-se processar no máximo 10 lâminas por experimento sob capela química. Prepare a incubação, meio contendo DAB e citocromo C em PBS e vortexie.
Adicione rapidamente dois microgramas de CDEs bovinos ao meio e misture bem por vortex. Para dispersar todos os grânulos de CDEs ainda ativos sob a capela, aplique de 150 a 200 microlitros de meio de incubação em cada lâmina utilizando a ponteira do pipetador para espalhar uniformemente em todas as seções. Incube as lâminas por 40 minutos a 37 graus Celsius.
Após 40 minutos, remova o meio de incubação das lâminas. Lave as lâminas quatro vezes em PBS durante 10 minutos cada vez. Após a lavagem, devolva as lâminas à câmara de coloração com tiras de papel úmidas, trabalhando sob uma capela química.
Prepare a solução de NBT em PBS, tomando cuidado para proteger o PMS da luz; vortexe a solução rapidamente. Aplique 150 a 200 microlitros da solução de NBT em cada lâmina, utilizando a ponteira da pipeta para espalhar uniformemente em todas as seções. Incube as lâminas por 40 minutos a 37 graus Celsius. Após 40 minutos, remova a solução em excesso das lâminas. Lave as lâminas quatro vezes em PBS, durante 10 minutos cada vez.
Desidrate as lâminas por dois minutos cada nas seguintes concentrações sequenciais de etanol: 70%, 70%, 95%, 95% e 99,5%. Por fim, deixe por 10 minutos em uma etapa adicional com 99,5%. Coloque as lâminas em xilol por 10 minutos, monte com LAN e aplique as lamínulas.
Deixe os lâminas secarem durante a noite ou pelo menos de uma a duas horas em um local ventilado aqui. Seções cerebrais de camundongos selvagens e com envelhecimento prematuro do tipo MT.DNA Mutator foram rotuladas sequencialmente para as atividades de COX e SDH.
A atividade normal de Cox indicada pela coloração marrom-escura é observada no hipocampo de camundongos selvagens. Deficiências de Cox indicadas pela coloração azul foram reveladas no hipocampo de camundongos mutadores de DNA mitocondrial em 12 e 46 semanas. Houve uma diminuição adicional da atividade de Cox aos 46 semanas de idade em camundongos mutadores de M-T-D-N-A, sugerindo uma exacerbação generalizada da disfunção da cadeia respiratória.
Tempos inadequados de incubação de 10 e 25 minutos resultaram em deposição reduzida do produto da reação marrom com DAB. Os tempos de incubação reduzidos permitiram a formação do produto final azul de Foran durante a incubação da SDH, sugerindo incorretamente a presença de células com deficiências de COX durante a aplicação das lamínulas. Os lâminas durante a incubação da COX também resultaram em formação e deposição imprecisa do produto da reação com DAB.
Embora as atividades da Cox e da SDH possam ser individualmente marcadas como mostrado aqui, a marcação sequencial demonstrou ser vantajosa para localizar células com disfunção mitocondrial. Um exemplo de controle de especificidade para as atividades da COX e da SDH no cérebro de um camundongo selvagem mostra marcação negativa. Portanto, não se esqueça de que trabalhar com os produtos químicos no protocolo de dupla marcação Cox-SDH é extremamente perigoso, e precauções, como usar roupas apropriadas de laboratório e máscara, trabalhar sob capela química e também descartar corretamente o meio de incubação, devem ser tomadas toda vez que este ensaio for realizado.
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Visão Geral
O método de dupla marcação citocromo c oxidase/desidrogenase do succinato (COX/SDH) permite a visualização de deficiências de enzimas respiratórias mitocondriais em cortes de tecidos frescos congelados. Esta técnica histoquímica é particularmente útil para investigar doenças mitocondriais e distúrbios relacionados ao envelhecimento.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Bioquímica
- Pesquisa Mitochondrial
Antecedentes
- A disfunção mitocondrial está associada a diversas doenças.
- Compreender as deficiências enzimáticas pode auxiliar no diagnóstico de distúrbios mitocondriais.
- As técnicas histoquímicas permitem a visualização direta da atividade enzimática.
- Seções de tecido fresco congelado preservam a arquitetura celular.
Objetivo do Estudo
- Visualizar deficiências de enzimas respiratórias mitocondriais.
- Investigar o papel da disfunção mitocondrial em doenças.
- Fornecer um método simples para pesquisadores.
Métodos Utilizados
- Coleta de cortes criostáticos do órgão de interesse.
- Realização da histoquímica de COX.
- Realização da histoquímica de SDH.
- Desidratação, montagem e aplicação de lamínulas em cortes de tecido.
Resultados Principais
- Os resultados indicam o nível de disfunção mitocondrial.
- A coloração azul celular correlaciona-se com a atividade enzimática.
- O método permite a visualização clara de deficiências enzimáticas.
- Os achados podem contribuir para a compreensão do envelhecimento e distúrbios relacionados.
Conclusões
- O método de dupla marcação COX/SDH é eficaz para o estudo da disfunção mitocondrial.
- Essa técnica pode auxiliar no diagnóstico de doenças mitocondriais.
- Oferece informações valiosas sobre as alterações mitocondriais relacionadas ao envelhecimento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação da função respiratória mitocondrial é fundamental para a validação de alvos em programas de doenças neurodegenerativas e relacionadas à idade. O método histoquímico de dupla marcação COX/SDH permite a visualização direta de deficiências enzimáticas, apoiando a eliminação de riscos mecanicistas de alvos mitocondriais. Essa abordagem fornece confiança preditiva no estágio inicial de descoberta, associando a integridade do DNA mitocondrial a leituras funcionais de bioenergética.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas ao relacionar a atividade da COX codificada pelo mtDNA à função da cadeia respiratória.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da leitura histoquímica direta da atividade enzimática em cortes de tecidos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao identificar compostos que revertam fenótipos deficientes em COX em modelos de doenças.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente ao estabelecer a função mitocondrial basal.
- Valor Operacional: Fornece dados quantitativos e com resolução espacial da atividade enzimática por meio da localização dos produtos DAB e NBT.
- Reutilização da Plataforma: Permite avaliação escalonável da saúde mitocondrial em múltiplos sistemas orgânicos utilizando fluxos de trabalho histoquímicos padronizados.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Alinha-se a sistemas relevantes para doenças ao modelar a disfunção mitocondrial observada no envelhecimento e em modelos mutadores de mtDNA.
- Valor Operacional: Oferece continuidade do descobrimento à validação pré-clínica por meio de leituras consistentes de atividade enzimática.
- Mitigação de Riscos: Informa decisões de avanço ajustadas ao risco mediante a quantificação da disfunção da cadeia respiratória ao longo do tempo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses sobre alvos até a identificação de compostos líderes e a validação pré-clínica, fornecendo leituras funcionais mitocondriais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao visualizar a atividade de COX e SDH em regiões cerebrais definidas.
- Triagem: Garante prontidão para ensaios por meio de etapas padronizadas de incubação, lavagem e desidratação, assegurando coloração reprodutível.
- Análises: Permite análise comparativa entre condições por meio da quantificação da coloração azul e marrom, correlacionada à atividade de SDH e COX.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao modelar a exacerbação dependente da idade da disfunção da cadeia respiratória em camundongos mutadores.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma histoquímica reutilizável para avaliação mitocondrial em diversas áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista em modelos de doenças mitocondriais.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade da visualização da atividade enzimática em cortes.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre prosseguir ou interromper projetos, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados em programas mitocondriais.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco, com base no resgate funcional de células deficientes em COX.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em histoquímica e biologia mitocondrial para a execução e interpretação precisas do ensaio.
- Depende de criostato, câmaras de incubação e capelas químicas para o preparo de cortes e manipulação de reagentes.
- Necessita padronização entre equipes quanto aos tempos de incubação, concentrações de reagentes e protocolos de lavagem para evitar artefatos.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método em tecidos não neurais, como coração ou fígado.
- Inclui limitações práticas, como a manipulação de reagentes perigosos (DAB, NBT, PMS) e a necessidade de preservação de tecidos frescos congelados.
