Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

O objetivo geral do experimento a seguir é obter diretamente e exclusivamente derivados neuronais de células-tronco embrionárias humanas pluripotentes utilizando indução por moléculas pequenas. Isso é alcançado pela adição de ácido retinóico a células indiferenciadas mantidas em condições definidas. Em seguida, o processo de diferenciação é continuado destacando-se as células em um cultivo em suspensão, onde elas formam aglomerados celulares flutuantes denominados neuroblastos.

Se os neuroblastos forem permitidos aderir a uma placa de cultura de tecidos em meio de diferenciação neural, eles desenvolvem características de neurônios maduros. Em última análise, a imunofluorescência e a microscopia de desconvolução ou confocal podem ser utilizadas para demonstrar o efeito do tratamento com ácido retinóico na morfologia e na expressão de marcadores de células-tronco embrionárias humanas tratadas. Em outras técnicas, apenas uma pequena fração de células adota um fenótipo neuronal, enquanto nosso método permite uma indução eficiente e bem controlada de células-tronco embrionárias humanas pluripotentes exclusivamente para uma linhagem neuronal por meio da simples adição de moléculas pequenas.

Existem algumas etapas que exigem cuidado ao preparar soluções estoque. É necessário descongelar lentamente o matrigel e a laminina humana de menos 80 graus Celsius para quatro graus Celsius durante a noite, armazenar o meio a quatro graus Celsius e sempre aquecê-lo a 37 graus Celsius antes do uso. Além disso, ao preparar o meio ESL humano, alguns dos suplementos são adicionados logo antes de seu uso.

Esses incluem BFGF, ácido ascórbico, insulina humana ativa na A e transferrina. Em seguida, prepare imediatamente as soluções trabalhadoras de gel de matrigel ou laminina humana antes do revestimento das placas. Incube as placas a 37 graus SIUs em 5% de dióxido de carbono após as placas de cultura tecidual pré-revestidas com gelatina estarem preparadas.

A gelatina pode ser substituída pela solução de trabalho de matrigel ou laminina. Revesta essas placas incubando-as durante a noite a quatro graus Celsius. Comece permitindo que colônias de células-tronco embrionárias humanas cresçam por cinco a sete dias e, em seguida, prepare-se para dividir.

Algumas delas Selecionam colônias com mais de 75% de células-tronco embrionárias humanas indiferenciadas, que geralmente são levemente opacas, com bordas definidas e contendo células empilhadas. Um indicativo do início da diferenciação geralmente são colônias brancas; colônias contendo predominantemente células diferenciadas geralmente parecem claras. Não selecione colônias brancas ou claras.

Segure as placas contra a luz e use uma caneta para delinear as colônias levemente opacas na parte inferior das placas, seguindo seus contornos. Use a borda de uma ponteira estéril de pipeta P2 para destacar a camada de fibroblastos ao redor da colônia de células-tronco embrionárias humanas. Em seguida, remova os fibroblastos circundantes e também todas as partes diferenciadas da colônia.

Agora aspire o meio antigo contendo as células diferenciadas destacadas. Em seguida, em cada poço, lave as células indiferenciadas uma vez com meio para células-tronco humanas E es sem BFGF e, então, adicione três mililitros de meio fresco de ESL humano contendo B-F-G-F — o B-F-G-F é adicionado ao meio fresco imediatamente antes do uso. Agora, use uma ponteira estéril P2 para cortar as colônias em pequenos pedaços e destacá-las da placa.

Puxe os fragmentos da colônia destacada, juntamente com o meio, para um tubo cônico de 50 mililitros. Puxe um mililitro adicional de meio de lavagem por poço.

As células estão agora prontas para diferenciação adicional utilizando moléculas pequenas. Comece aquecendo as placas recém-revestidas a 37 graus Celsius. Aspire a solução de revestimento das placas e adicione um alíquota de quatro mililitros de meio contendo fragmentos de colônias a cada poço, em seguida transfira suavemente as placas para uma incubadora sem agitá-las.

Não perturbe as placas para que possam haver a adesão celular. Após três dias de adesão, prepare um novo meio contendo ácido omegá-3. Em seguida, remova a maior parte do meio antigo, deixando apenas o suficiente para que as células permaneçam submersas.

As células nunca devem secar. Adicione quatro mililitros de meio fresco para células ES humanas com BFGF e ácido retinóico. Substitua o meio a cada dois dias e permita que as colônias de células ES humanas tratadas com ácido retinóico cresçam.

Após sete ou oito dias, as células terão sofrido alterações morfológicas, transformando-se em grandes células diferenciadas. Em seguida, prossiga com a preparação de um cultivo celular em suspensão: para iniciar um cultivo em suspensão, desprenda as colônias de ESL das células que se diferenciaram espontaneamente e migraram para fora, formando uma camada de fibroblastos. Utilize a técnica mencionada anteriormente com uma ponteira estéril e, em seguida, aspire o meio antigo contendo as células de fibroblastos destacadas e em suspensão.

Lave as células uma vez com meio HESC e re-suspenda-as em três mililitros de meio HESC. Agora, utilizando uma ponteira estéril P2, corte as colônias em pequenos pedaços e desprenda-as da placa.

Recolha o meio com as colônias destacadas em um único tubo cônico de 50 mililitros. Enxágue as cavidades com um mililitro de meio e adicione o enxágue ao meio coletado. Em seguida, alíquota quatro mililitros das células reunidas em cada cavidade de uma placa de seis cavidades com aderência ultrabaixa por quatro a cinco dias, mantendo a placa em uma incubadora.

Neste período, aglomerados celulares flutuantes ou neuroblastos se formarão, promovendo o avanço do neuroblasto para um fenótipo neuronal mais maduro. Recolha o meio contendo-os em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, centrifugue as células a 1.400 RPM durante cinco minutos.

Aspire, pese o máximo possível do meio antigo e adicione uma quantidade igual de meio NSC fresco contendo VEGF N NT três e BDNF. Suspender as células por pipetagem e, em seguida, distribua quatro mililitros da suspensão por poço em placas de cultura celular de seis poços. Transfira as placas para um incubador umidificado a 37 graus Celsius.

O neuroblasto aderirá às placas de cultura durante a noite para um cultivo 3D em Matrigel ou laminina humana adicionada à suspensão de neuroblastos. E uma matriz 3D se polimerizará a 37 graus Celsius. Substitua o meio a cada dois dias.

Em duas semanas, extensas redes de células neuronais com neuritos e células pigmentadas aparecerão. O ácido retinóico é suficiente para induzir células-tronco embrionárias humanas mantidas no sistema de cultura definido a transitar da pluripotência exclusivamente para um fenótipo neuroepidermal. Após a exposição de células-tronco embrionárias humanas indiferenciadas ao ácido retinóico, todas as células dentro da colônia sofreram alterações morfológicas, transformando-se em grandes células diferenciadas que deixaram de expressar o marcador associado à pluripotência OCT4. As células também começaram a expressar diversos marcadores associados ao neuroectoderma, como HNK-1a, P2 e TRKC.

Essas grandes células diferenciadas continuaram a se multiplicar e as colônias aumentaram de tamanho, expressando espontaneamente o marcador neuronal inicial beta três tubulina. O marcador neuronal mais maduro map dois começou a aparecer em áreas das colônias onde as células haviam se acumulado. Coincidentemente, com o surgimento das células neuroectodérmicas, o fator de transcrição específico neuronal NER um, implicado na diferenciação neuronal dopaminérgica e na ativação do gene da tirosina hidroxilase, translocou-se para o núcleo.

Após a dissociação, as células-tronco humanas tratadas com ácido retinóico formaram neuroblastos em cultura de suspensão após a remoção do FGF básico e, após permitir que os neuroblastos aderissem a uma placa de cultura de tecidos, extensas redes de células neuronais com neuritos e células pigmentadas, típicas do SNC, começaram a aparecer com um aumento drástico na eficiência e puderam ser cultivadas por mais de três meses. Essas células neuronais derivadas de células-tronco humanas expressaram a tubulina beta três em comparação com a diferenciação multilinial espontânea de células não tratadas com ácido retinóico e coexpressaram a MAP2. Uma vez dominada, esta técnica pode ser utilizada para gerar progenitores neuronais em células neuronais de forma uniforme a partir de células-tronco embrionárias humanas pluripotentes em cerca de quatro semanas, se realizada corretamente.

Não se esqueça de que trabalhar com células humanas pode ser extremamente perigoso, e precauções, como garantir que as linhagens celulares estejam livres de patógenos e micoplasma, devem sempre ser tomadas antes de realizar este procedimento.