Síntese em fase sólida Submonomer de Polímeros Peptoid e seus Automontagem em altamente ordenada nanofolhas

O objetivo geral deste procedimento é descrever um método simples e eficiente para a síntese de peptídeos em fase sólida e a autoagregação aquosa de peptídeos em nanolâminas altamente ordenadas. Estruturalmente semelhantes aos polipeptídeos, os peptídeos são polímeros de glicina substituída em que as cadeias laterais estão ligadas ao nitrogênio em vez do carbono alfa. O processo inicia-se com a síntese de uma sequência peptídica específica por meio do método de submonômero.

O método do submonômero consiste em duas etapas químicas simples que introduzem cada monômero na cadeia sequencialmente. Primeiro, uma amina ligada a um suporte sólido é bromoacetilada. Segundo, o brometo é substituído por uma amina primária.

Esses passos são repetidos até que o comprimento da cadeia desejado seja alcançado. Após a alongamento da cadeia, o peptídeo é clivado do suporte sólido e o óleo bruto de peptídeo resultante é purificado por CLAE e caracterizado para iniciar a automontagem de peptídeos em nanofolhas. Uma solução aquosa diluída do peptídeo é preparada em um vial de vidro e misturada suavemente. Como etapa final.

As nanoestruturas são examinadas ao microscópio. Os resultados demonstram que um ciclo iterativo de duas etapas químicas simples pode gerar um polímero com sequência específica que se autoorganiza espontaneamente em nanoestruturas. Os peptídeos são uma classe nova de polímeros inspirados na biologia, com propriedades intermediárias entre as das proteínas e dos polímeros tradicionais.

Eles são robustos e sinteticamente versáteis como os polímeros tradicionais, mas também são altamente ajustáveis e específicos em sequência, como as proteínas e o DNA. Os peptídeos estão surgindo como um material avançado para abordar problemas fundamentais na biomedicina e na ciência dos materiais, tais como a identificação de fármacos bioativos ou o projeto de proteínas artificiais. As principais vantagens dos peptídeos incluem controle preciso da sequência, disponibilidade de blocos constituintes incrivelmente diversos, síntese eficiente e estabilidade frente a proteases. O método geral de síntese manual de peptídeos, que envolve equipamentos básicos e reagentes comercialmente disponíveis, é descrito aqui, permitindo que peptídeos sejam facilmente sintetizados na maioria dos laboratórios.

A demonstração visual das etapas sintéticas é fundamental e serve como referência valiosa para indivíduos que ingressam na área da síntese em fase sólida. Pela primeira vez aqui, a purificação e caracterização de um peptídeo anfifílico com 36 resíduos são descritas, bem como sua automontagem em nanolâminas altamente ordenadas. Inicie este protocolo com a montagem do aparato experimental conforme descrito no protocolo escrito.

Os seguintes passos serão realizados em um vaso de reação de vidro em vez de uma cartucho fritado descartável de polipropileno, para maior clareza. Após a montagem, adicione 100 miligramas de resina de amida R a um vaso de reação fritado e deixe a resina absorver o solvente, adicionando dois mililitros de dimetilformamida ou DMF, agitando mediante borbulhamento por 10 minutos. Em seguida, drene a solução por vácuo para isolar a resina inchada.

Em seguida, adicione um mililitro de piridina metílica a 20% completo em DMF para desproteger o grupo FM O. Agite por dois minutos e drene. Repita este processo por 12 minutos, depois enxágue a resina adicionando dois mililitros de DMF, agitando por 15 segundos e drenando.

Inicie o crescimento da cadeia peptídica com o primeiro ciclo de submonômero, que inclui uma bromoacetilação e uma etapa de deslocamento. Para a bromoacetilação, adicione um mililitro de ácido bromoacético 0,6 molar em DMF e 86 microlitros de diisopropilcarbodiimida. Após agitar por 30 minutos, drene e lave com dois mililitros de DMF.

Em seguida, realize o deslocamento adicionando um mililitro de amina de um a dois molar em metil pirógeno, incube por 30 a 120 minutos. Após a incubação, drene e lave com dois mililitros de DMF. Novamente, continue o crescimento da cadeia peptídica repetindo o ciclo de submonômero. Após a conclusão do deslocamento final, lave com dois mililitros de DMF.

A seguir, realize uma tampa de lavagem com metano diórico e armazene o vaso de reação até a clivagem. Para iniciar a clivagem, transfira toda a resina seca para um frasco de vidro de cintilação de 20 mililitros, trabalhando dentro de uma capela e utilizando equipamento de proteção individual adequado; adicione quatro mililitros de ácido tri-fluoro-acético, ou coquetel de clivagem TFA, ao frasco de vidro de cintilação e tampe. Agite vigorosamente por 10 minutos a 2 horas à temperatura ambiente.

Alternativamente, utilize um agitador rotativo para misturar a solução. Colete a solução de clivagem com TFA filtrando a resina por meio de uma cartela descartável fritada de polipropileno em um novo frasco de vidro para cintilação de 20 mililitros previamente pesado. Em seguida, adicione um mililitro de coquetel de clivagem fresco para enxaguar a resina e coletar qualquer peptídeo residual.

Repita este passo, enxágue duas vezes. Evapore o TFA passando um fluxo suave de nitrogênio ou utilizando um evaporador Biot Charge. No evaporador V 10, redissolva o óleo bruto em seis mililitros de uma mistura de acetonitrila e água na proporção de 1:1.

Em seguida, congele e liofilize a amostra. Esse processo deve ser repetido mais uma vez após a segunda liofilização. Registre o peso do produto bruto e armazene-o como um pó seco a menos 20 graus Celsius, utilizando uma combinação de HPLC analítica com detector de arranjo de diodos e/ou espectrometria de massas com ionização por spray eletrospray (LCMS).

A pureza do produto bruto e se o peso molecular desejado está presente podem ser determinados seguindo os procedimentos descritos no texto. A mistura bruta de peptídeos pode então ser purificada por meio de CLAE preparativa em fase reversa, conforme o procedimento descrito. Esta seção descreve o protocolo para formar folhas a partir de uma sequência de cadeia única específica de peptídeo anfifílico com 36 me.

Após a síntese, purificação e liofilização da cadeia peptídica, o pó branco resultante é dissolvido em DMSO para preparar uma solução estoque de dois milimolares. Em seguida, obtenha um arquivo Dr.Glass para preparar uma solução de peptídeo de 20 micromolares. Primeiro, adicione 445 microlitros de água milli Q e 50 microlitros de tampão 10 x para formação de folha.

Vortex a ampola para homogeneizar. Em seguida, adicione cinco microlitros de uma solução estoque de peptídeo a dois milimolares e agite suavemente. As lâminas da solução resultante são formadas pela agitação suave da solução aquosa diluída de peptídeo.

Inclinando lentamente o frasco de vidro com tampa da posição horizontal para a posição vertical. Resulta em agitação suave em folhas, também produz folhas. No entanto, as folhas tendem a ser menores e com menos bordas retas em comparação com muitas folhas de alta qualidade.

Gire lentamente os frascos de vidro em torno do eixo horizontal por um dia utilizando um rotador de tubos ou um agitador personalizado para a coloração fluorescente de nanolâminas; adicione um microlitro de vermelho de Nile a 100 micromolares a 100 microlitros da solução de nanolâminas para obter uma concentração final de um micromolar de Nile. O vermelho de Nile é um corante sensível ao ambiente, cuja intensidade de fluorescência aumenta quando se localiza em ambientes hidrofóbicos. Em seguida, prepare uma solução de aros a 1% em água quente e despeje em uma placa de Petri de plástico.

Assegure-se de que a solução de aros tenha aproximadamente um oitavo de polegada de espessura e deixe a solução esfriar sem perturbação sobre uma superfície plana. Após a solidificação do aros, use uma espátula para cortar quadrados de um centímetro por um centímetro. Em seguida, transfira os quadrados cortados para uma lâmina de vidro para coletar as folhas no mesmo plano, aplicando um microlitro da solução de folha sobre o pedaço de aros.

Após dois minutos, os aros devem absorver o tampão, deixando as lâminas na superfície. Imagem a lâmina dentro de 15 minutos. Alternativamente, para imagens de lâminas e solução, carregue 15 microlitros dentro de uma junta de 0,12 milímetro de diâmetro de 20 milímetros em uma lâmina de vidro.

Cubra a amostra com uma lamínula e realize a imagem em poucos dias para executar a MEV de nanofolhas. Primeiro, faça a corrosão a plasma de pastilhas de silício para auxiliar na absorção das nanofolhas. Em seguida, adicione 20 microlitros de solução de folhas peptídicas sobre um substrato de silício tratado por plasma e deixe a solução repousar; após três minutos, remova o excesso de solução com a ponta de uma pipeta de papel Kim, adicione 20 microlitros de água sobre a superfície e, novamente, remova o excesso de solução por capilaridade para eliminar o tampão e os sais.

Alternativamente, as soluções de folhetos peptídicos são diálisadas contra água para remover tampão e sal. Nesse caso, 20 microlitros da solução de folhetos diálisada podem ser depositados sobre os substratos de silício tratados por plasma e deixados secar ao ar. Após a solução de folhetos secar nos substratos de silício tratados por plasma, o folheto pode ser analisado por MEV utilizando um detector interno a energias do feixe entre um quilovolt e cinco quilovolts.

A síntese, caracterização e purificação de um peptídeo com carga em bloco 36 me específico para sequência, que se dobra em uma nano folha bidimensional altamente ordenada, foi realizada. As aminas utilizando a síntese do peptídeo com carga em bloco 36 me ligarão etilenodiamina a fenetilamina e t-butil beta-alanina. Após a síntese, o peptídeo bruto foi clivado da resina com TFA aquoso 95%.

Após a solução de TFA ter sido coletada e evaporada, o peptídeo bruto com carga do bloco 36 me foi purificado por HPLC em fase reversa. A massa do peptídeo com carga do bloco purificado foi então confirmada por moldy.

A massa observada de 4981,2 é muito próxima da massa calculada de 4981,74. O pó liofilizado foi dissolvido em DMSO para preparar uma solução estoque de dois milimolares e armazenado a quatro graus Celsius. Lâminas foram preparadas pelo protocolo acima mencionado e analisadas por microscopia óptica de fluorescência.

Uma variedade de formas com tamanhos de características que variam até 300 micrômetros é observada, e notavelmente bordas retas são proeminentes. A MEV também foi utilizada para imagens das lâminas, revelando de forma semelhante bordas retas proeminentes. Este vídeo descreve um protocolo simples e eficiente para a síntese em fase sólida de peptídeos e a autoagregação em meio aquoso de peptídeos em nanolâminas.

Como literalmente centenas de blocos de construção de aminoácidos estão prontamente disponíveis e podem ser utilizados neste protocolo, o espaço de design acessível com polipeptídeos é praticamente ilimitado. Os peptídeos são materiais promissores para pesquisas em biomedicina e nanociência devido à sua flexibilidade sintética, robustez e capacidade de organização. Em particular, no nível atômico, as nanoestruturas em folha servem como uma plataforma potencial para andaimes de exibição bidimensional, miméticos de membranas, sensores biológicos, miméticos de proteínas e fabricação de dispositivos.

Trabalhar com reagentes corrosivos, como trior, ácido acético e ácido bromoacético, é extremamente perigoso; para prevenir lesões, realize todas as reações em uma cabine de segurança química e use equipamentos de proteção individual adequados.