Comparação quantitativa de Cis-Regulamentação elemento (CRE) Atividades em transgênicos Drosophila melanogaster

O objetivo geral deste procedimento é medir quantitativamente as atividades reguladoras de genes em elementos reguladores CIS ou CREs ativos durante o desenvolvimento metamórfico de drosophila melan gastro. Inicie com métodos de integração em sítios específicos para gerar linhagens de CREs incorporados transgênicamente como transgenes repórter. Utilizando um microscópio estereoscópico, obtenha espécimes transgênicos do estágio de desenvolvimento correto.

Remova os espécimes do pub externo e monte-os em um microscópio de vidro. Prossiga para registrar o nível e o padrão de expressão da proteína repórter fluorescente em amostras inteiras por meio de análise microscópica confocal. Por fim, quantifique o nível de expressão da proteína repórter fluorescente nas imagens confocais registradas utilizando a ferramenta de software Image J.

Esses resultados atribuem um nível de atividade regulatória gênica ao elemento regulatório auxiliar e facilitam estudos comparativos adicionais de expressão gênica em versões modificadas de CRE. Este procedimento pode ajudar a responder perguntas fundamentais e interessa-se pela regulação gênica e por como essa regulação gênica é codificada. O DNA interessa-se pela biologia do desenvolvimento e evolutiva.

Este procedimento foi desenvolvido para fornecer informações sobre elementos reguladores cis que atuam durante o desenvolvimento metamórfico de drosophila melanogaster. Em princípio, no entanto, pode ser aplicado a elementos reguladores cis que funcionam em outras fases do desenvolvimento e em outras espécies de moscas-das-frutas, ou até mesmo em outros organismos modelo. Para expandir as linhagens transgênicas, monte dois frascos com vários machos e fêmeas em dias alternados.

Transfira as moscas de um dos frascos para um novo frasco. Repita isso por uma semana. Ao final de duas semanas, verifique se as moscas transgênicas apresentam estágios de desenvolvimento que variam desde larval até adulto.

Inicie o estadiamento dos espécimes no final do terceiro estágio larval, quando o ER for formado. Observe que o espécime é não móvel. O ER é branco amolecido e as esféricas apresentam especificidade desviada, indicando este ponto temporal.

Como zero HAPF. Distinguiu-se machos de fêmeas pela presença de gônadas situadas bilateralmente próximo ao ponto médio do corpo, que aparecem como círculos translúcidos para o estadiamento com base no comprimento da metamorfose. No zero HAPF, transfira os espécimes para um frasco novo utilizando um pincel umedecido.

Adicione um pedaço de papel absorvente e umedeça com água para evitar que os espécimes sequem. Agora, incube o frasco a 25 graus Celsius até o HAPF desejado. Alternativamente, classifique os espécimes ordenando-os com base na identificação da presença e posição de diversos marcadores morfológicos conforme detalhado no texto acompanhante.

Com fita de laboratório, fixe um pedaço de fita adesiva a uma placa de dissecação com a superfície adesiva voltada para cima. Umedeça um pincel e aplique umidade aos espécimes utilizando um pincel. Transfira os espécimes para uma toalha de papel Kim.

Transfira os espécimes para a fita adesiva e fixe-os com a superfície dorsal voltada para cima. Deixe os espécimes secarem por 15 minutos. Abra progressivamente o ER usando pinça.

Inicie na extremidade anterior ou anterior e prossiga em direção à extremidade posterior. Em seguida, transfira o espécime para uma gota de óleo viscoso em uma lâmina de microscópio e avalie a amostra microscopicamente para espécimes em montagem total. Utilize o objetivo Forex ou 10 x para focalizar o espécime.

Utilizando o software do microscópio confocal, ajuste o comprimento de onda de excitação para a proteína fluorescente desejada para evitar o desbotamento fotônico. Comece com uma intensidade de laser de cinco a 10%. Se o sinal for insuficiente, aumente a intensidade conforme necessário para melhorar a relação sinal-ruído. Para imagens confocais, ative as configurações de software que façam a média das medidas de pixels a partir de varreduras replicadas, como a média de Kalman, para comparações quantitativas da atividade de CRE, utilizando a seção C onde a fluorescência aparece mais intensa.

Altere para uma tabela de consulta de aviso de saturação e ajuste o ganho de tensão e o deslocamento do canal para configurações nas quais poucos pixels estejam saturados. Se necessário, ajuste a abertura confocal. Uma vez determinadas as configurações ideais, execute a varredura ZS para obter uma série de imagens ao longo do eixo Z.

Quando a varredura estiver concluída, converta a pilha de imagens em uma projeção e salve esse arquivo de imagem no formato TIF. Para comparação quantitativa das atividades de CRE, utilize as mesmas configurações de microscopia confocal para todos os espécimes replicados e linhagens de transgênico repórter. Para o experimento com o programa Image J, inicie abrindo uma imagem TIFF a ser avaliada.

Clique no botão de seleção desenhada à mão livre e delimite a área do espécime onde se deseja a quantificação. Para obter uma estatística do valor do pixel, clique na guia analisar e depois selecione medir. Registre a pontuação média do valor do pixel a partir da caixa de resultados.

Também colete um segundo valor médio de pixel de uma região de fundo onde o CRE não está ativo. Para obter um valor médio de pixel ajustado, continue gerando estatísticas de valores de pixel para espécimes replicados. Em seguida, a partir dos valores médios de pixel ajustados das réplicas, determine a atividade regulatória média para um CRE A e também calcule o erro padrão da média.

Este experimento utiliza a intensidade do fenótipo de olho branco resgatado para tornar linhagens transgênicas homozigotas. Um fundo genético mutante do gene white com uma sequência de sítio de integração A TTP é utilizado para integração específica de transgene. Indivíduos transgênicos, hemizigotos e homozigotos para o vetor integrado, são diferenciados pela intensidade do fenótipo de cor dos olhos resgatada, determinada pelo número de cópias do gene mini white integrado.

Linhas homozigotas são então estabelecidas cruzando moscas macho e fêmea com o fenótipo de cor de olho mais escuro. Marcadores morfológicos são utilizados para determinar o estágio metamórfico de drosófila durante a metamorfose de larva para mosca adulta. O espécime passa por uma série de morfologias estereotipadas que podem ser usadas para determinar o sexo e estimar o estágio de desenvolvimento. Aqui.

Uma versão selvagem de um CRE denominado elemento dimórfico induz altos níveis de expressão do repórter EGFP no segmento abdominal ASIC de fêmeas de puy. Uma sequência de 13 pares de bases dentro desse CRE foi identificada como sítio de ligação para o fator de transcrição DSX, e a importância in vivo dessa sequência é demonstrada pela quantificação da atividade reguladora do CRE quando esse sítio de ligação é mutado. Análises quantitativas indicam que a mutação desse sítio DSX reduziu a atividade reguladora para 28 mais ou menos 3% da expressão selvagem no contexto do sítio de inserção do transgene utilizado aqui.

Comparações semelhantes avaliam atividades regulatórias para alelos de CRE intraespecíficos ou entre CREs autólogos de espécies distintas, por exemplo, em comparação com os níveis de EGFP no segmento feminino. Um seis impulsionado pelos CREs autólogos da cepa D Melin gastric Canin S para as espécies D stimulants e D willi possui atividades regulatórias iguais a 75 mais ou menos 4% e zero mais ou menos 0%, respectivamente. Métodos de procedimento como interferência de RNA podem ser utilizados com genes de fatores de transcrição para responder perguntas adicionais sobre como esses genes de fatores de transcrição interagem com elementos regulatórios CYS.

Isso seria indicado pelo aumento e diminuição da expressão da proteína repórter fluorescente, que são controlados por elementos regulatórios CIS após seu desenvolvimento. Este procedimento abriu caminho para pesquisadores na área de regulação gênica explorarem a importância funcional que motivos de elementos regulatórios cis e mutações evoluídas têm sobre a expressão gênica.