Atividades de monitoramento quinases e fosfatases através do ciclo celular por raciométrica FRET

Neste vídeo, as atividades de quinase e fosfatase são monitoradas ao longo do ciclo celular utilizando transferência de energia por ressonância de Förster ou FRET. Aqui, uma sonda de atividade da polo-like quinase 1 ou PLK1 possui a proteína fluorescente ciano (CFP) posicionada em uma extremidade e a proteína fluorescente amarela (YFP) posicionada na outra. Esta sonda é transfectada em células U2 OS.

Em seguida, para examinar o estado de fosforilação de LK que atua durante a transição G2/M, as células U2 OS transfectadas são submetidas à imagem de fluorescência com lapso de tempo. Quando CFP e YFP estão em proximidade próxima e CFP é excitado, ocorre transferência de energia para YFP, podendo-se detectar a emissão de YFP. No entanto, quando a sonda é fosforilada, uma mudança conformacional na proteína separa CFP e YFP.

Agora, quando o CFP é excitado, detecta-se uma forte emissão de CFP e apenas uma fraca emissão de YFP. A quantificação da razão entre a emissão de YFP após excitação de CFP e de YFP demonstra que a atividade da PLK1 aumenta na fase G2 e atinge um pico durante a mitose. Assim, a principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a filmagem geométrica padrão, é que se presta atenção específica para que o ciclo celular não seja perturbado nem pelas condições de filmagem nem pela expressão de uma sonda. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área do ciclo celular, como onde e quando quinases ou fosfatases específicas são ativadas.

Embora este método possa fornecer informações sobre enzimas reguladas pelo ciclo celular, ele também pode ser aplicado a outros sistemas onde condições de desres são necessárias, como ensaios de proliferação celular. Para monitorar o ciclo celular humano, células U2 OS são transfectadas com uma sonda baseada em fret para atividade de PK um. Utilizando um método padrão de transfeção com fosfato de cálcio, as células são selecionadas em puromicina por pelo menos sete dias.

Isso enriquece a população de células que expressam a sonda e limita o número de células com níveis de expressão tóxicos ou níveis de expressão que afetam severamente o ciclo celular. Clones estáveis são então selecionados por diluição limitante; a expressão de CFP e YFP é então examinada para verificar se estão presentes em todas as células em uma proporção aproximadamente igual. Se algumas células contiverem apenas CFP ou YFP, provavelmente ocorreu recombinação; neste caso, repita o preparo do plasmídeo utilizando bactérias menos propensas à recombinação homóloga, como as células sure two, em seguida linearize o plasmídeo e repita a transfeção.

Uma vez que as células expressem estavelmente a sonda, semeie-as em placas com fundo de vidro nº 1,5 após a adesão e quando atingirem de 30 a 50% de confluência. Substitua o meio por um meio independente de CO₂ e sem vermelho de fenol, e monte as células em um microscópio de fluorescência episcópica motorizado com controle de temperatura ajustado a 37 graus centígrados. O microscópio deve ser equipado com filtros de excitação e emissão para CFP e YFP.

Um espelho ROIC apropriado para monitorar CFP e YFP e uma objetiva adequada para a resolução exigida. Aqui, utiliza-se uma objetiva de 20 x NA 0,75 de ar. Usando luz transmitida, coloque as células em foco.

Não utilize luz fluorescente neste momento, pois ela induzirá uma resposta de estresse que pode perturbar o ciclo celular. Para evitar a fototoxicidade, ajuste a abertura para o valor máximo disponível que permita a resolução subcelular necessária. Para este experimento, deve ser possível distinguir o núcleo e o citoplasma.

Defina um tempo de exposição curto e insira um filtro neutro de alta densidade. Em seguida, adquira uma imagem de teste de 12 ou 16 bits utilizando excitação e emissão de YFP. Ajuste o tempo de exposição e os filtros neutros de densidade para que a intensidade média em uma célula seja aproximadamente igual à intensidade de fundo mais cinco vezes a diferença entre as intensidades mínima e máxima de fundo. Para verificar se as imagens não estão saturadas, examine a intensidade de fluorescência da imagem da amostra.

A intensidade máxima na imagem deve ser inferior à metade da faixa dinâmica para permitir diferenças de intensidade quando as células entrarem em mitose. Em seguida, repita este processo utilizando filtros de excitação CFP e de emissão YFP. Selecione múltiplas regiões com células transfectadas, excluindo as regiões utilizadas para foco e otimização das condições de exposição.

Como esses procedimentos podem ter induzido uma resposta de estresse, certifique-se de que a intensidade máxima seja inferior à metade da faixa dinâmica em todas as células. Instrua o software a adquirir duas imagens a cada 45 minutos utilizando excitação YFP, emissão YFP e excitação CFP. Filtros de emissão YFP.

Também defina a duração total do experimento para que exceda o período do ciclo celular. Após configurar todos os parâmetros, inicie a aquisição de imagens; ao concluir a aquisição, abra as imagens obtidas e monitore o tempo do ciclo celular da mitose à mitose. Para células que expressam a sonda transfectada aqui, o tempo do ciclo celular foi de aproximadamente 20 a 25 horas.

Compare isso com os dados de controle do tipo celular utilizado. Se o tempo do ciclo celular corresponder aos tempos de referência, o fret pode ser analisado. Uma vez que o tempo tenha sido verificado, as imagens podem ser analisadas.

A análise pode ser realizada pela maioria dos softwares dedicados à microscopia. Aqui, utiliza-se o software livre Image J com o plugin Ratio Plus. Inicie a análise abrindo as imagens no Image J. Se as imagens estiverem em formato de pilha multicolorida, separe os canais individuais convertendo-as em uma pilha hiper por meio da seleção de imagem.

Em seguida, hiperpilha e depois pilha para hiperpilha. A janela converter para hiperpilha abre com as configurações exibidas; clique em OK. A imagem será agora exibida com duas barras deslizantes abaixo dela.

Próximo a dividir as imagens em pilhas de canal único, clique na imagem e selecione reduzir dimensionalidade de hiperpilha. Isso abrirá a janela de redução; certifique-se de que quadros e manter origem estejam selecionados. Em seguida, clique em OK.

Uma nova imagem contendo apenas um canal aparecerá. Repita este processo para exibir uma nova imagem com o segundo canal. Em seguida, para aumentar a clareza visual das imagens finais, selecione a pilha de excitação YFP e emissão YFP.

Clique em processar, depois clique em matemática. Em seguida, multiplique. Quando a janela de multiplicação abrir, insira três para multiplicar a pilha de excitação de YFP e emissão de YFP por três. Esta etapa é opcional e garante que as proporções não estejam na faixa entre zero e um.

Em seguida, na barra de ferramentas da imagem J, selecione a ferramenta de desenho à mão livre. Depois, na pilha de excitação YFP e emissão YFP, desenhe uma região de interesse ou ROI em uma área isenta de células, mas próxima a uma célula que será medida. Para adicionar a ROI ao gerenciador de ROI, clique em ferramentas de análise. Em seguida, gerenciador de ROI.

A janela do gerenciador de ROI será exibida. Clique em adicionar para salvar as coordenadas do ROI e medir a intensidade média do ROI na pilha de excitação YFP e emissão YFP. Clique em analisar e depois selecione medir.

A janela de resultados será aberta. Selecione a pilha de emissão YFP com excitação CFP. Em seguida, clique duas vezes na ROI no gerenciador de ROI e repita a medição.

A medição é adicionada à janela de resultados. Role para outras posições na pilha para repetir este processo em múltiplos pontos de tempo. Verifique se as intensidades de fundo próximas à célula de interesse são semelhantes ao longo de todo o filme, comparando as medições na janela de resultados.

Para definir as medições incluindo a intensidade mínima, clique em analisar, depois clique em definir medições e indique o valor mínimo e máximo de cinza. Uma janela mostrando alternativas de medição aparecerá em seguida. Após ajustar o brilho e o contraste conforme necessário, desenhe uma ROI que cubra a maior parte de uma célula e meça a intensidade mínima em ambas as pilhas.

Em seguida, realize as medições como antes, mas desta vez utilizando uma célula em vez do fundo. Usando os valores das seções de resultados, calcule a diferença entre a intensidade mínima medida e a intensidade do fundo e divida-a por dois. Isso fornece uma estimativa inicial para um valor de corte para a razão plus select plugins.

Em seguida, razão aditiva. Depois, para a razão FRET, selecione a pilha S de excitação CFP e emissão YFP um ou, para a razão FRET invertida na visualização de sondas em que a eficiência FRET diminui após fosforilação, selecione a pilha S de excitação YFP e emissão YFP um para inserir as intensidades de fundo medidas e os valores de corte.

Utilize os valores da janela de resultados e cole-os na janela de proporção adicional. Ajuste a escala da pilha de proporções resultante e aplique uma tabela de consulta adequada para visualizar as alterações na proporção. Células U2 OS que expressam uma sonda baseada em fret para monitoramento da atividade de PLK um foram filmadas por 60 horas conforme descrito neste vídeo.

Esta imagem mostra a entrada mitótica cumulativa de 50 células que expressam a sonda fret, incluindo as divisões das células filhas. A maioria das células que expressam a sonda prolifera com um tempo de ciclo celular entre 20 e 25 horas, indicando que as condições de imagem e os níveis de expressão da sonda não afetam o cronograma do ciclo celular. Uma representação em cores falsas da razão fret invertida ao longo de quatro divisões de uma célula demonstra que, embora haja um ruído considerável, observa-se uma tendência na qual a atividade da PK um aumenta na fase G dois e atinge um pico durante a mitose.

Quando os dados brutos são filtrados pela média e apresentados em forma de gráfico, o intervalo entre os picos de atividade é fácil de estimar. Esta figura mostra a quantificação da razão FRET invertida da célula exibida nas imagens anteriores, a partir do gráfico. O momento da ativação pode ser estimado e, como pode ser visto aqui, a fosforilação da sonda torna-se visível aproximadamente quatro horas antes do pico de fosforilação na mitose.

Ao realizar este procedimento, é importante manter as células em condições não estressantes, o que é feito minimizando a exposição à luz, bem como as variações de temperatura ou pH. Também é importante lembrar que este método monitora o equilíbrio entre a atividade de quinases e fosfatases em uma célula. Este procedimento pode ser combinado com interferência de RNA ou telas de inibidores para identificar os reguladores upstream dessas quinases e fosfatases.