Métodos de detecção de fluorescência para as plataformas de gotículas microfluídicos

Olá, eu sou Jersey. Oi, meu nome é Shabi e somos ambos pesquisadores pós-doutorais no Imperial College de Londres, trabalhando com o Professor Andrew Di Melo e o Dr. Josh Del em plataformas microfluídicas de gotículas. As plataformas microfluídicas baseadas em gotículas são candidatas promissoras para experimentação de alto rendimento, pois podem ser geradas com volumes muito bem definidos e precisos, e suas frequências de geração podem atingir vários quilohertz.

Além disso, como a região de interesse pode ser encapsulada em compartimentos tão pequenos quanto alguns litros, tanto a interferência cruzada quanto a dispersão podem ser eliminadas, e os processos analíticos podem ser cronometrados com maior precisão. Em nosso grupo, já implementamos com sucesso plataformas de microgotas em diversas aplicações. Por exemplo, reação em cadeia da polimerase, síntese de nanopartículas e o ensaio de célula molecular única.

As grandes quantidades de informações geradas nesses sistemas devem ser extraídas, aproveitadas e utilizadas de forma eficiente. Nesse sentido, o método de detecção escolhido deve ser adequado, oferecer alta sensibilidade e baixos limites de detecção, ser aplicável a uma variedade de espécies moleculares, ser não destrutivo e poder ser integrado com dispositivos microfluídicos de maneira simples. Para atender a essa necessidade, desenvolvemos um conjunto de ferramentas e protocolos experimentais que permitem a extração de grandes quantidades de informações físicas de ambientes de pequeno volume, e que são aplicáveis à análise de uma ampla gama de fenômenos físicos, químicos e biológicos.

Neste protocolo, apresentaremos dois métodos aplicados à detecção de células individuais e ao mapeamento de processos de mistura no Dropbox. Os chips microfluídicos são tradicionalmente fabricados em poli-dimetil-siloxano (PDMS) utilizando métodos de fotolitografia. Este processo deve ser realizado em uma instalação de sala limpa para obter canais microfluídicos Spinco, SU 8 50 sobre uma plaqueta de silício, com pré-assamento em placa aquecida a 65 e 95 graus para evaporar o solvente e densificar a película; após o resfriamento, expor a resistência SU 8 à radiação UV sob a máscara apropriada e, em seguida, assar a plaqueta a 65 e 95 graus após o resfriamento.

Desenvolva as áreas não expostas utilizando a solução reveladora apropriada sob agitação. Enxágue a pastilha com solvente EC fresco e, em seguida, seque-a sob fluxo de gás para gerar uma superfície limpa. Trate a pastilha com lavagens de hexano e metanol.

Além disso, para concluir o processo de fabricação do molde mestre, evapore um agente de fixação sobre a superfície em um dessecador por 40 minutos. Para formar substratos microfluídicos estruturados, misturamos o S guard 1 8 4 numa proporção de 10 para 1 de resina e agente de reticulação e aplicamos essa mistura sobre o molde mestre. Dessupere este no dessecador e cure o dispositivo a 65 graus.

Corte o PDMS curado e retire-o do molde. Crie orifícios de acesso para tubos fluidos usando um furador de biópsia. Cure outra camada de PDMS por 20 minutos a 65 graus.

Coloque a camada superior preparada sobre a camada inferior e cure durante a noite a 65 graus. Retire as pastilhas do recipiente de Petri e pique-as. Uma vez que as pastilhas tenham sido fabricadas, elas estão prontas para serem utilizadas mediante infusão das soluções de interesse.

Encha as seringas com as soluções necessárias, garantindo que não permaneçam bolhas de ar em nenhuma parte das tubulações. Para a geração de gotículas, são utilizadas duas fases. A fase dispersa aquosa contém os reagentes de interesse.

A fase oleosa atua como a fase contínua, adaptando tubos com o mesmo diâmetro interno das pontas das agulhas das seringas a uma das extremidades, montando as seringas em uma bomba de seringa e definindo a taxa de fluxo de infusão desejada. Para cada fase, recomenda-se uma razão mínima de fluxo oleoso/aquoso de um para evitar a molhagem do PDMS pela fase aquosa, o que resultaria em formação instável de gotículas. Conecte as outras extremidades dos tubos diretamente aos orifícios perfurados no substrato de PDMS.

Para soluções mais complexas, também podem ser implementadas sílica, portas capilares ou conectores. Conecte a porta de saída do chip ao tubo e direcione-o para um coletor para descarte ou processamento adicional de análise. Uma vez montado esse sistema, existem duas configurações principais de microcanais para gerar gotas: foco de fluxo ou formato de junção em T, resultantes das forças cisalhantes que surgem ao usar essas geometrias para unir os dois fluidos admissíveis e das respectivas interações capilares que se desenvolvem na interface.

Uma gota de oh dispersa gera espontaneamente gotículas tão pequenas quanto algumas femtolitros. Uma vez que as gotículas são geradas, elas podem ser analisadas usando uma configuração óptica. O sistema óptico é configurado de acordo com o seguinte protocolo.

Utilize um microscópio confocal com capacidade automatizada de posicionamento em escala submicrométrica e um laser operando em um comprimento de onda que corresponda à absorção dos fluoróforos envolvidos. Para excitá-los, use um laser de pulso operando em taxas de repetição de várias megahertz para imageamento de tempo de vida fluorescente. Experimentos de flegm utilizam espelhos de direcionamento de feixe e óptica para controlar a altura do feixe, bem como a direção do feixe.

Utilize um espelho dicróico para refletir o feixe a laser na lente objetiva. Se dois lasers forem usados simultaneamente, pode-se instalar um espelho dicróico de banda dupla. Para permitir a reflexão dos dois feixes a laser, utilize uma objetiva de microscópio com alta abertura numérica corrigida para infinito (NA) para focalizar com precisão a luz a laser dentro de um canal microfluídico.

Colete a fluorescência emitida pela amostra dentro do canal microfluídico, utilizando o mesmo objetivo de alta abertura numérica (NA) e transmitida através do mesmo espelho dicromático. Remova qualquer luz de excitação residual utilizando um filtro de emissão de banda simples ou dupla. Foque a emissão de fluorescência em um orifício de 75 micrômetros.

Usando uma lente plano-convexa. Posicione o orifício de agulha no plano confocal da objetiva do microscópio. Utilize outro espelho dicróico para dividir o sinal fluorescente em dois detectores.

Filtre a fluorescência refletida pelo espelho dicromático com um filtro de emissão e foque-a com uma lente plano-convexa no primeiro detector. Para experimentos que envolvem um fluoróforo vermelho secundário, filtre a fluorescência transmitida pelo espelho dicromático com outro filtro de emissão e, em seguida, foque-a com outra lente plano-convexa no segundo detector. Utilize fotodiodos de avalanche para a detecção de fótons de fluorescência.

Para a aquisição de dados de fluorescência, acople o sinal eletrônico do detector de fotodiodo de avalanche a um dispositivo multifuncional de aquisição de dados (DAQ) para registro de dados operando em um computador pessoal. Para experimentos com fleuma, utilize um laser de pulso e conecte os detectores a uma placa TCS PC (contagem de fótons únicos com correlação temporal) operando em um computador separado. Esta placa permite obter os dados de tempo de vida fluorescente.

Utilizando uma metodologia TCS PC. Cada fóton fluorescente detectado é correlacionado a um pulso a laser incidente e, portanto, a cada fóton fluorescente emitido é atribuído um tempo de atraso. Esses dados podem ser ajustados a uma curva de decaimento exponencial simples ou múltipla para obter uma estimativa da taxa radiativa dos fluoróforos.

Agora sabemos que as células são altamente heterogêneas sob as perspectivas biológica, física e química. Portanto, idealmente, deveríamos analisar cada célula de cada vez. No entanto, os ensaios devem ser realizados com maior produtividade para que possamos coletar informações quantitativas suficientes para chegar a uma conclusão confiável e significativa.

Aqui temos um exemplo de encapsulação de células de E. coli em uma única gota, de modo que possa ser realizada. Utilize a linhagem de E. coli top 10 cultivada durante a noite. Para detectar a viabilidade das células, use citono nove e iodeto de propídio.

Os dois corantes são corantes intercalantes de DNA e sua intensidade de fluorescência aumenta mais de 20 vezes. Ao ligar-se ao DNA, a citocina é um corante fluorescente verde que é permeável à membrana, e o iodeto de propídio é um corante fluorescente vermelho, que é impermeável à membrana.

Assim, as células vivas fluorescem em verde, enquanto as células mortas exibem emissões verde e vermelha. Aqui podemos observar a geração de gotículas e a encapsulação individual de uma célula com uma junção em T. Este vídeo foi gravado com uma câmera de alta velocidade, mas as gotículas podem ser geradas a uma taxa de milhares por segundo.

Ao encapsular células, é necessário garantir que o cultivo celular seja diluído de modo que haja menos células do que gotículas geradas, e que as células sejam impedidas de sedimentar, o que pode ocorrer na seringa ou nos tubos. Utilize um agitador magnético dentro da seringa para manter as células uniformemente distribuídas na solução. Use tubos muito finos, de 50 micrômetros, para conectar a seringa ao microchip.

Isso garante uma taxa de fluxo rápida no interior do tubo e, portanto, impede a sedimentação das células. Abaixo seguem exemplos típicos de contagens de fótons em função do tempo para experimentos com base em células. Para mapear os processos de mistura dentro de gotículas.

Gotas podem ser geradas usando dois fluoroforos diferentes com tempos de vida distintos. Dentro de uma gota em fluxo, um campo de escoamento é gerado, o qual eventualmente mistura as duas soluções originalmente separadas, potencializando o processo de mistura. A simetria do campo de escoamento pode ser alterada mediante o uso de canais sinuosos.

Para investigar as gotículas, foque o volume do sonda óptica na metade da altura de um microcanal ao longo do qual as gotículas estão fluindo, começando de um lado do canal, e realize cada experimento ao longo de toda a largura do canal. Em intervalos de um micrômetro. Implemente um algoritmo para diferenciar as rajadas únicas associadas às gotículas ao ruído de fundo da fase oleosa e para determinar a duração de cada rajada.

Implemente um segundo algoritmo para extrair os valores de tempo de atraso e intensidade ao longo do comprimento de cada gotícula na largura específica onde o experimento foi realizado. Em seguida, utilize um algoritmo de estimador de máxima verossimilhança (MLE) para avaliar o tempo de vida de fluorescência de cada gotícula no experimento. A média dos valores de tempo de vida de todas as gotículas no experimento reduz o erro final do cálculo do MLE.

Quanto mais gotículas forem analisadas, menor será o erro após a obtenção de uma trajetória de tempo de vida. Para cada largura, combine todas as trajetórias em um mapa 2D. Como cada valor de tempo de vida está associado a uma mistura particular dos dois florocromos, pode-se assim obter um mapa de concentração ou de mistura.

Descrevemos a fabricação de um dispositivo microfluídico e a montagem experimental, juntamente com os protocolos associados para a formação de microgotas, encapsulamento em regiões específicas e detecção óptica do processo e das gotas. Os dois exemplos selecionados — a detecção de células individuais em gotas e o mapeamento dos processos de mistura — representam aplicações comuns atualmente investigadas na microfluídica de gotas.

Como os experimentos apresentados ilustram, o uso de plataformas de microfluídica de gotas apresenta certas características atrativas, como alto rendimento, confinamento perfeito e maior reprodutibilidade. A grande quantidade de informações produzidas e a alta velocidade com que essas informações são geradas exigem o uso de métodos de detecção rápidos com a mais alta resolução espacial e temporal, caso se deseje obter o máximo proveito dessas plataformas miniaturizadas.

Neste caso, demonstramos que isso é possível utilizando técnicas espectroscópicas fluoretadas altamente precisas.