Cirurgia Nó murino superficial linfático
21 de maio de 2012
Para seguir a progressão de uma resposta imune ao longo do tempo dentro do mesmo rato, gânglios linfáticos pode ser sequencialmente removido por cirurgia. Aqui, nós descrevemos como esta técnica pode ser realizada.
O objetivo geral deste procedimento é remover cirurgicamente os linfonodos de um camundongo anestesiado. Isso é realizado primeiramente localizando os linfonodos. Os linfonodos são coletados e, em seguida, a incisão é fechada.
Finalmente, pode-se obter uma suspensão de células isoladas para análise experimental. Em última instância, as populações viáveis de linfócitos podem ser avaliadas por citometria de fluxo. A demonstração visual desta técnica é essencial, pois a localização e remoção dos linfonodos precisam ser observadas para que sejam dominadas.
Após anestesiar o camundongo, aplique pomada nos olhos, injete buprenorfina e confirme a sedação por meio do aperto no dedo do pé, então posicione o camundongo de lado. Primeiro, localize o linfonodo braquial e, em seguida, retire os pelos da região a ser dissecada. Após remover os pelos soltos, aplique um desinfetante na região e, então, faça uma pequena incisão de cerca de cinco milímetros na parte traseira da pata traseira.
Use dois pares de pinças para esticar a incisão até que o nó linfático braquial, que pode apresentar coloração acinzentada ou mais escura que a gordura circundante, fique visível. Em seguida, segure a fáscia que recobre o nó linfático com um par de pinças. Coloque o segundo par de pinças o mais abaixo possível sob o nó linfático e puxe levemente a membrana sem romper o tecido circundante.
Em seguida, use o primeiro par de pinças para romper a fáscia e remover o nó linfático. Se o nó linfático foi colhido com sucesso, uma mancha de sangue aparecerá no local onde ele estava anteriormente. Coloque o nó linfático ressecado em uma solução isotônica; se ele afundar, isso confirmará que o tecido colhido é um nó linfático e não gordura.
Em seguida, verifique se não há pelos na ferida e feche a incisão unindo as bordas internas da pele e grampeando-as com um ou dois clipes, dependendo do tamanho da incisão. Agora, localize um linfonodo inguinal e depile a região a ser dissecada. Após remover quaisquer pelos soltos com uma escova, aplique um desinfetante na região e, então, faça uma pequena incisão de cerca de cinco milímetros acima da pata traseira, próxima ao abdômen.
Após abrir a incisão com dois pares de pinças, conforme mostrado anteriormente para o linfonodo braquial, identifique o linfonodo inguinal alojado no tecido adiposo circundante. Em seguida, remova o linfonodo com os dois pares de pinças, tal como demonstrado anteriormente. Novamente, confirme a coleta bem-sucedida do linfonodo observando a mancha de sangue que aparece no local onde o linfonodo estava anteriormente, e então coloque o linfonodo inguinal em um recipiente separado contendo solução isotônica.
Após a coleta de todos os linfonodos, coloque o camundongo em uma gaiola e adicione alimento úmido para que ele possa se alimentar facilmente. Cerca de seis a oito horas após a cirurgia, verifique o camundongo para garantir que não esteja sentindo dor. Observe atentamente se a postura, a marcha, a interação com os companheiros e a aparência da pelagem são semelhantes às de um camundongo normal e saudável.
Por fim, dissocie o linfonodo pressionando-o contra lâminas fosqueadas em uma placa de Petri e, em seguida, transfira-o para um tubo para obter uma suspensão de células simples. Após a marcação das células para os antígenos de superfície celular de interesse, analise as células por citometria de fluxo. Aqui, são apresentados gráficos de dispersão frente e lateral de amostras de linfonodos obtidos de animais anestesiados ou sacrificados.
Os perfis e porcentagens de células nas portas de linfócitos viáveis dos dois diagramas de dispersão são os mesmos. Isso demonstra que a cirurgia de linfonodo é uma técnica apropriada para coletar células. Uma vez dominada, a cirurgia de linfonodo pode ser realizada em cinco a dez minutos por camundongo, se for feita corretamente.
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Visão Geral
Este artigo descreve uma técnica cirúrgica para remoção sequencial de linfonodos de um camundongo anestesiado, a fim de acompanhar a resposta imune ao longo do tempo. O procedimento inclui a localização dos linfonodos, sua coleta e o fechamento da incisão, seguido pela obtenção de uma suspensão de células únicas para análise.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Técnicas Cirúrgicas
- Análise Experimental
Antecedentes
- Compreender as respostas imunes é essencial na pesquisa.
- Os linfonodos desempenham um papel fundamental no sistema imunológico.
- A remoção sequencial permite a análise temporal das respostas imunes.
- Técnicas visuais aprimoram a aprendizagem e o domínio do procedimento.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar a remoção cirúrgica de linfonodos em camundongos.
- Facilitar o estudo da progressão da resposta imune.
- Fornecer um guia visual para pesquisadores.
Métodos Utilizados
- Localização de linfonodos em um camundongo anestesiado.
- Remoção cirúrgica de linfonodos.
- Fechamento da incisão após a cirurgia.
- Preparação de uma suspensão de células únicas para análise.
Resultados Principais
- A remoção bem-sucedida dos linfonodos foi realizada.
- Foram obtidas populações viáveis de linfócitos.
- A citometria de fluxo foi utilizada para a avaliação dos linfócitos.
- Demonstrações visuais melhoraram a compreensão da técnica.
Conclusões
- A técnica permite o rastreamento eficaz das respostas imunes.
- Os recursos visuais são essenciais para dominar procedimentos cirúrgicos.
- Estudos futuros podem se basear neste método para obter insights mais profundos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A cirurgia sequencial de linfonodos permite o acompanhamento longitudinal de respostas imunes dentro do mesmo animal, reduzindo a variabilidade experimental e apoiando a desmistificação mecanicista na validação de alvos. Essa abordagem fornece linfócitos viáveis em quantidade suficiente para ensaios fenotípicos e funcionais, aumentando a confiança preditiva em estudos pré-clínicos de imunologia. Ao facilitar experimentos de curso temporal, a técnica apoia a continuidade translacional desde a descoberta até a validação pré-clínica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da análise temporal da expansão de linfócitos em linfonodos.
- Valor Operacional: Reduz o uso de animais e a variabilidade experimental ao realizar amostragens repetidas no mesmo camundongo.
- Valor Científico: Apoia a desmistificação biológica ao caracterizar fenótipos de linfócitos residentes em linfonodos ao longo do tempo.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera 1-2x10⁶ células por linfonodo, quantidade suficiente para caracterização fenotípica e ensaios funcionais.
- Valor Operacional: Fornece suspensões celulares padronizadas e reprodutíveis para análise subsequente por citometria de fluxo.
- Valor Científico: Permite a preparação de sistemas biológicos validados para avaliação confiável de compostos em triagem imunológica.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a modelagem de sistemas relevantes para doenças por meio do acompanhamento da dinâmica das células imunes em linfonodos ao longo do tempo.
- Valor Operacional: Facilita o alinhamento translacional de biomarcadores por meio do monitoramento imunológico longitudinal.
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao permitir a eliminação mecanicista de riscos em vias mediadas pelo sistema imunológico.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses até a validação pré-clínica, apoiando o rastreamento da resposta imune e a análise funcional de linfócitos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias por meio do perfilamento temporal da resposta imune.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios por meio de suspensões de células únicas reprodutíveis obtidas de linfonodos coletados.
- Análises: Gera populações quantitativas de linfócitos para comparação baseada em citometria de fluxo entre diferentes pontos temporais.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta à validação pré-clínica por meio do monitoramento imune contínuo em sistemas relevantes para a doença.
- Reutilização Corporativa: Representa uma capacidade cirúrgica reutilizável para estudos longitudinais de imunologia em múltiplos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio do acompanhamento longitudinal da resposta imunológica.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade na coleta e processamento de linfócitos.
- Valor Estratégico: Decisões aprimoradas de avançar/não avançar por meio da redução da ambiguidade mecanicista em programas de imunologia.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco com base em dados temporais de resposta imunológica provenientes de amostragens sequenciais.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em técnicas cirúrgicas em camundongos e protocolos de anestesia.
- Necessita de instrumentos estéreis e soluções isotônicas para preservação do tecido.
- Exige padronização entre equipes para localização e coleta consistentes dos linfonodos.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes sítios de linfonodos (braquial, inguinal) e linhagens de camundongos.
- Limitado pelos intervalos de recuperação pós-operatória, permitindo amostragem a cada dois dias por linfonodo.
