Campo elétrico controlado de migração dirigida de células progenitoras neurais em ambientes 2D e 3D

O objetivo geral deste procedimento é registrar o efeito dos campos elétricos aplicados na migração de células progenitoras neurais em culturas 2D e modelos ex vivo 3D. Isso é realizado primeiramente isolando e expandindo células progenitoras neurais in vitro. O segundo passo é preparar uma suspensão simples de células progenitoras neurais.

Em seguida, para o preparo do cultivo 2D, células progenitoras neurais são semeadas em câmaras eletrotáticas especialmente projetadas. Alternativamente, para o preparo do modelo ex vivo 3D, as células progenitoras neurais são marcadas com os marcadores 3, 3, 3, 4, 2 e injetadas em um modelo organotípico de fatia de medula espinhal. Por fim, um campo elétrico é aplicado às câmaras eletrotáticas e é realizada uma gravação com lapso de tempo para demonstrar que as células progenitoras migram em direção ao cátodo do campo elétrico em ambos os ambientes, 2D e 3D.

A principal vantagem desta técnica é que ela fornece um método inovador para o rastreamento em tempo real da migração induzida por campo elétrico de células individuais após o transplante em um modelo organotípico tridimensional, que se assemelha estreitamente ao ambiente natural. Este método não apenas pode fornecer informações detalhadas sobre a técnica eletrotáxica e a migração de células neurais transplantadas em fatias de medula espinhal, mas também pode ser aplicado a outros sistemas, como modelos de fatias cerebrais menores. Para iniciar este procedimento, prepare tiras de vidro de 22 por 11 milímetros dividindo ao meio uma tira autoclavada de 22 por 22 milímetros.

Corte ao meio lâminas de cobertura de espessura número um utilizando uma caneta de diamante. Em seguida, crie um poço de vidro autossustentável com dimensões internas de 22 por 10 milímetros, colando quatro tiras verticais de 22 por 11 milímetros juntas com graxa de silicone de alto vácuo; deixe o poço secar e endurecer completamente durante a noite. No dia seguinte, fixe duas tiras de vidro de 22 por 11 milímetros paralelamente uma à outra, deixando um espaço de 10 milímetros, à base de uma placa de cultura de 100 milímetros, utilizando graxa de silicone.

Em seguida, vedar a região entre essas tiras fixando uma lamínula de 22 por 22 milímetros com graxa de silicone. Colocar o poço de vidro sobre as lamínulas de modo que as paredes internas criem um espaço confinado para o plaqueamento das células. Impermeabilizar todas as junções com graxa de silicone.

Cubra esta região confinada sequencialmente com policloreto de lisina, seguido por laminina, conforme descrito no manuscrito suplementar. Neste procedimento, obtenha os cérebros de camundongos E14 a E16 e coloque-os em meio basal D-M-E-M-F12 frio. Em seguida, remova as meninges sob um microscópio anatômico.

Em seguida, transfira os cérebros para uma placa de Petri de 35 milímetros. Use a pinça fina para dissociar os cérebros em fragmentos de tecido. Depois, transfira-os para um tubo cônico de 15 mililitros.

Centrifugue as amostras a 800 RPM durante três minutos para remover os detritos D. Em seguida, adicione A-D-M-E-M-F 12 contendo BFDF e DGF às amostras. Triture-as com uma pipeta de um mililitro.

Em seguida, obtenha a suspensão de células isoladas utilizando um filtro celular. Plaque as células nos frascos a 20.000 a 50.000 células por mililitro. Em seguida, realize uma troca completa do meio a cada três dias, o que envolve centrifugar as células a 1.300 RPM durante cinco minutos.

Descarte o sobrenadante do Resus, suspenda o PT em meio fresco e devolva as células ao frasco a cada seis dias após pelo menos cinco. Transfira as NEUROESFERAS para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue a 1.500 RPM durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante.

Re-suspenda o pellet em trips em EDTA para obter uma suspensão de células isoladas. Antes de realizar a contagem celular, prepare um mililitro de suspensão contendo 10.000 células. Em seguida, remova a laminina do poço de vidro e deixe secar completamente.

Substitua por um mililitro de suspensão celular. Em seguida, coloque a placa no incubador a 37 graus Celsius por um mínimo de quatro horas para permitir a adesão. Uma vez que as células estejam suficientemente confluentes, remova o meio da câmara.

Remova cuidadosamente o vidro. Em seguida, forme um teto sobre as células fixando cuidadosamente uma lamínula de vidro autoclavada de 22 por 22 milímetros entre duas tiras de 22 por 11 milímetros com graxa de silicone. Lembre-se de cobrir as células com algumas gotas de meio para evitar a secagem.

Em seguida, forme um reservatório de meio isolado em cada extremidade da câmara, criando duas barreiras estanques de graxa de silicone que se estendem de uma extremidade da placa até a outra. Preencha a câmara com meio fresco, garantindo um fluxo contínuo de um reservatório de meio para o outro. Posteriormente, retorne a placa ao incubador por 12 horas para permitir a recuperação celular.

No próximo passo, prepare uma tampa para cobrir a placa perfurando dois orifícios, um posicionado sobre cada reservatório da câmara de migração. Em seguida, substitua o meio na câmara por meio cultivado contendo tampão hippies 25 milimolar. Depois disso, transfira a placa para o sistema de imageamento com controle de temperatura.

Defina os parâmetros experimentais para a gravação com lapso de tempo e múltiplas posições. Alinhe a câmara de modo que o cátodo e o ânodo fiquem à esquerda e à direita, respectivamente, para garantir que o vetor do campo elétrico percorra horizontalmente, conforme visualizado ao microscópio e registrado no sistema de imagem. Em seguida, encha dois béqueres.

Com a solução de Steinberg. Conecte um béquer separado a cada reservatório de meio usando as pontes de vidro previamente preparadas contendo solução de ágar a 2% de Steinberg. Em seguida, coloque os eletrodos de prata conectados a uma fonte de corrente contínua na solução de Steinberg.

Em cada béquer, ajuste o seletor de voltagem da fonte de alimentação para zero e ligue-a. Meça a voltagem através da câmara eletrotática com um voltímetro enquanto aumenta o seletor de voltagem. Em seguida, ajuste a voltagem conforme as exigências experimentais.

Após isso, inicie a gravação em lapso de tempo. Realize uma troca de meio e reajuste a voltagem conforme necessário. A cada hora, adicione ao reservatório meio fresco, fármacos ou agentes químicos conforme necessário.

Usando orifícios adicionais perfurados na tampa da placa de cultura, um posicionado sobre cada reservatório de meio. Nesta etapa, dissecar as medulas espinhais lombares de camundongos com duas semanas de idade. Em seguida, cortar as medulas espinhais em seções com espessura de 500 mícrons utilizando um cortador de tecidos machel wane sob microscópio anatômico.

Seccione as fatias e selecione aquelas com estrutura medular sagital axial intacta. Em seguida, plaque as fatias em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 30 microlitros de gel MA. Posicione-as o mais próximo possível do centro.

Mantenha-os em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Para que as proteínas da matri gel se autoorganizem e produzam uma película fina que recobre a superfície dos cortes de medula espinhal, é muito importante que a matri gel tenha sido completamente montada. Incube o recipiente de Petri a 37 graus Celsius por mais 30 minutos, se necessário, e então adicione de quatro a seis mililitros de meio D-M-E-M-F 12 contendo tampão heis a 25 milimolares e 15 a 20% de soro fetal bovino.

Muito suavemente, para evitar que o meio flua diretamente sobre as fatias, certifique-se de que as fatias não estejam completamente submersas no meio, deixando a superfície das berinjelas bem exposta ao ar. Troque o meio duas vezes por semana. Incube agora a suspensão de células progenitoras neurais no meio com cinco micromolares de hooks.

3, 3, 3, 4, 2 durante 30 minutos. Sob um microscópio, utilize um tubo de vidro capilar para microinjetar dois microlitros da suspensão no corte de medula espinhal. Lentamente, certifique-se de que o tubo de vidro capilar atravesse o matrigel e alcance o interior do corte de medula espinhal.

Mantenha o tubo de vidro dentro da fatia de medula espinhal por pelo menos 30 segundos para evitar suspensão celular. Aguarde, em seguida coloque a placa de Petri contendo a fatia de medula espinhal no incubador a 37 graus Celsius com 5 por cento de dióxido de carbono durante a noite. No dia seguinte, monte uma câmara eletrotática ao redor da fatia de medula espinhal contendo células de neurogênese rotuladas 3 3 3 4 2 antes de aplicar um campo elétrico medindo 500 milivolts por milímetro.

Aqui, as células progenitoras neurais mostram uma migração altamente direcionada em direção ao cátodo quando expostas a campos elétricos; as linhas vermelhas e as setas azuis representam, respectivamente, as trajetórias e a direção do movimento celular. E aqui está o gráfico dos caminhos de migração mostrados. Abaixo estão as células progenitoras neurais marcadas com hooks 3 3, 3, 4 2.

Eles foram transplantados para a fatia orgânica da medula espinhal no ponto inicial do tratamento com campo elétrico. Após as células progenitoras neurais terem migrado direcionalmente em direção ao cátodo por 2,5 horas, a polaridade do campo elétrico foi invertida. A alteração da polaridade do campo elétrico desencadeou uma rápida inversão do eixo em direção ao novo cátodo.

Aqui está uma imagem das células progenitoras neurais transplantadas dentro da fatia de medula espinhal. Ao final da gravação em lapso de tempo, é mostrada uma reconstrução tridimensional das células progenitoras neurais transplantadas dentro da fatia de medula espinhal. Domínio completo.

Essa técnica pode ser realizada em duas semanas, se for executada corretamente após seu desenvolvimento. Essa técnica agora abre caminho para pesquisadores na área de biologia celular explorarem a migração de células progenitoras neurais em sistemas de cultura 2D e 3D em resposta e aplicação a campos elétricos.