Multiplexados molécula única Força Medidas proteólise, usando uma pinça magnética

O objetivo geral deste procedimento é estudar o efeito da carga mecânica sobre a clivagem proteolítica de proteínas individuais de maneira altamente paralela e economicamente eficiente. Nesta demonstração, a clivagem do colágeno pela metaloproteinase matricial um é examinada na primeira etapa: os trimers de colágeno são ligados à lamínula de vidro de uma câmara de fluxo, seguido pela ligação de microesferas magnéticas de tamanho micrométrico às moléculas individuais de colágeno. O segundo passo consiste em montar a câmara de fluxo no aparelho de pinças magnéticas e verificar se as microesferas ligadas de forma não específica foram removidas da superfície da lamínula.

Em seguida, a protease é adicionada às células de fluxo. O passo final consiste em determinar a taxa de proteólise monitorando a liberação das microesferas em tempo real. Ao medir as taxas de liberação das microesferas em diferentes concentrações de protease e forças aplicadas, é possível derivar parâmetros cinéticos zoológicos padrão utilizando quantidades mínimas de substrato e protease.

Além disso, esta técnica fornece informações únicas sobre o efeito da força mecânica na taxa de proteólise e nas alterações estruturais na proteína substrato que acompanham a clivagem. A principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos, como traços ópticos T e microscopia de força atômica, é que esta técnica é de alto rendimento e economicamente eficaz. Embora este método possa oferecer insights sobre a força efetiva na clivagem proteolítica de proteínas individuais, os instrumentos e técnicas podem ser aplicados a uma ampla gama de problemas biofísicos, incluindo o efeito da força sobre o dobramento e a conformação de proteínas.

Inicie a preparação da câmara de fluxo limpando lamínulas por meio de sonicador. Adicione as lamínulas a um recipiente de vidro pequeno capaz de contê-las e que caiba no sonicador. Encha o recipiente com isopropanol e sonique em banho ultrassônico por 20 minutos, em seguida descarte o isopropanol e enxágue as lamínulas com grandes quantidades de água desionizada.

Encha o recipiente com água e sonique por 20 minutos. Após a sonicação, seque as lamínulas em um fluxo de ar filtrado isento de poeira. Inspecione as lamínulas e utilize apenas as que estiverem livres de manchas.

Aqueça suavemente as lamínulas por alguns segundos para limpá-las de qualquer poeira e umidade remanescentes, passando-as por uma chama de gás produzida por um bico de Bunsen, tomando cuidado para não deformar a lamínula devido ao excesso de calor. Este passo remove contaminantes residuais da superfície.

Em seguida, use fita adesiva dupla face para unir os dois lamínulas. Primeiro, corte a fita com aproximadamente três centímetros de comprimento e 0,3 centímetros de largura e, então, fixe-a a um lamínula de 22 por 40 milímetros, deixando um canal de 1,6 centímetro no centro. Use a ponta de uma pipeta para pressionar suavemente o lamínula, garantindo que a fita tenha aderido corretamente.

O equipamento de pinças magnéticas foi construído por este laboratório utilizando um suporte em formato de L de alumínio com um orifício circular de um milímetro de diâmetro, montado sobre um tradutor vertical em Z para modular a altura das pinças. Dois ímãs permanentes de terras raras foram fixados no suporte em ambos os lados do orifício para criar o gradiente de campo magnético. A calibração adequada da armadilha magnética é essencial para este procedimento.

Para garantir o sucesso, utilizamos dois métodos diferentes descritos nesta seção. Para calibrar a armadilha magnética, utilize DNA previamente preparado do fago Lambda, marcado nas extremidades cinco primas e três primas com biotina e digoxigenina, conforme descrito no protocolo escrito. Para ligar o DNA à célula de fluxo, primeiro preencha a célula de fluxo com solução de anticorpo anti-digoxigenina e deixe o anticorpo aderir à superfície de vidro por 15 minutos.

Em seguida, bloqueie a superfície da câmara de fluxo para evitar a adesão não específica de DNA, adicionando uma solução de BSA à câmara de fluxo. Observe que, para esta etapa de bloqueio e todas as etapas subsequentes, o volume do reagente adicionado à câmara de fluxo deve ser pelo menos duas vezes maior que o volume da câmara de fluxo, que nesta demonstração é de 75 microlitros; incube a câmara de fluxo à temperatura ambiente por 45 minutos.

Após repetir esta etapa, adicione 50 pico molar de DNA lambda funcionalizado e deixe-o aderir à lamínula por 15 minutos, removendo o excesso de DNA com um XPBS. Por fim, adicione microesferas superparamagnéticas revestidas com estreptavidina e deixe-as aderir ao DNA imobilizado por 15 minutos. Nesta demonstração, são utilizadas microesferas de 2,8 micrômetros.

Lave os excessos de microesferas com um XPBS. Em seguida, realize a calibração dos pinças magnéticas movendo os ímãs permanentes para uma posição distante da superfície da amostra. Depois, coloque a cela de fluxo preparada no microscópio.

Posicione os ímãs permanentes acima da célula de fluxo. Escolha o plano focal das microesferas funcionalizadas com DNA Lambda focalizando nas microesferas distantes das duas superfícies de vidro. O plano focal correto é aquele em que as microesferas desejadas apresentam um centro brilhante.

Filme o movimento das microesferas com frequência superior a 80 hertz por 500 quadros. Aproxime o ímã da superfície da amostra e grave um vídeo do movimento das microesferas em cada posição. Para distâncias superiores a cinco milímetros, mova em incrementos de um milímetro nas distâncias entre um e cinco milímetros.

Mova-se em incrementos de 0,5 milímetro para distâncias menores que um milímetro, mova-se em incrementos de 0,25 milímetro. Para cada conjunto de dados, rastreie o centro das microesferas utilizando um ajuste gaussiano 2D. Calcule a força por meio das flutuações brownianas conforme descrito no procedimento escrito. Confirme a precisão das forças verificando o cálculo da força por meio de um ajuste espectral de potência de Lian.

Para determinar a frequência de rolamento, a relação entre a força aplicada e a frequência de rolamento pode ser determinada no texto anterior à fixação do peptídeo de colágeno nas células de fluxo, expressar e purificar as proteínas do peptídeo de colágeno e da MMP-1. Comece adicionando a solução de anticorpo anti-Mic à célula de fluxo e incube-a à temperatura ambiente por 20 minutos para permitir que o anticorpo anti-Mic se ligue à superfície da célula de fluxo. Bloqueie a célula de fluxo para prevenir a ligação não específica de proteínas usando BSA a cinco miligramas por mililitro. Adicione 150 picomolares de peptídeo de colágeno e permita que ele se ligue ao anticorpo por meio da marcação M-ttag durante 45 minutos.

Lave o excesso de colágeno usando tampão PBS antes de adicionar as microesferas de 2,8 micrômetros à célula de fluxo. Elas devem ser separadas da solução de microesferas revestidas com strep divid por meio de ímãs fortes e, em seguida, ressuspendidas em PBS. Esse processo deve ser repetido três vezes.

Esta etapa é essencial para garantir que as microesferas de 2,8 micrômetros se liguem ao peptídeo de colágeno imobilizado na superfície. Em seguida, adicione microesferas superparamagnéticas revestidas com estreptavidina e permita que elas se liguem às moléculas de colágeno por 45 minutos. Uma vez que a câmara de fluxo esteja montada com o peptídeo de colágeno e as microesferas magnéticas, realize a imagem da câmara de fluxo na armadilha magnética.

Sob baixa força, uma subpopulação das microesferas é por vezes fraca, aderida à superfície de maneira não específica. A aplicação de uma força moderada garante que essas microesferas sejam liberadas. Adicione enzima ativada à célula de fluxo.

Neste caso, a MMP um foi previamente ativada pela adição de 3,5 milimolar de PMA e incubada a 37 graus Celsius por três horas. Assim que uma câmara de fluxo é reintroduzida no aparelho de pinças magnéticas, grave um vídeo abrangendo alguns campos de visão, gerando tipicamente várias centenas de microesferas ligadas. Esta medição corresponde ao tempo igual a zero.

Repita o mesmo processo de gravação de diversos campos de visão em intervalos regulares de tempo até que todas as esferas se desprendam ou não seja mais possível discernir proteólise adicional. As pinças magnéticas foram calibradas para esferas de um micrômetro e 2,8 micrômetros. Utilizando tanto a magnitude das flutuações brownianas observadas quanto o cálculo da frequência de rolloff em diferentes posições do ímã nos experimentos de proteólise forçada, o número normalizado de esferas remanescentes pode ser representado graficamente em função do tempo para determinar a taxa de proteólise.

E este processo pode ser repetido com diferentes concentrações de enzima e forças. As taxas de proteólise dependem da força aplicada. As taxas de proteólise foram determinadas em um pico Newton, 6,2 pico Newtons e 13 pico Newtons.

A fração de microesferas não processadas, em tempos superiores a 15 minutos, permanece aproximadamente constante em 0,25 entre diferentes experimentos. No nosso caso, o ensaio permitiu medir a eficiência catalítica da MMP-1 em função da força aplicada. Ao analisar os dados, descobrimos que a hélice tripla do colágeno deve se desenrolar localmente antes da proteólise.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cinco a seis horas, se feita corretamente. É importante lembrar que pelo menos 30 a 50 microesferas por campo de visão são necessárias para obter boa significância estatística dos seus dados. Não se esqueça de que o A PMA pode ser extremamente perigoso e precauções, como luvas, jalecos laboratoriais e máscara facial, devem sempre ser utilizadas durante a realização deste experimento.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir o efeito da força na clivagem proteolítica de proteínas individuais utilizando pinças magnéticas. As pinças magnéticas são uma excelente ferramenta para compreender experimentos biofísicos de molécula única. Esta técnica pode ser estendida a outras combinações de protease e substrato.

Além disso, técnicas semelhantes podem ser utilizadas para compreender a dinâmica estrutural de proteínas, bem como para estudar outras proteínas que se ligam ou modificam RNA e/ou DNA.