Modelagem e imagem 3-Dimensional Invasion cela coletiva

Este sistema experimental tem como objetivo caracterizar a contribuição de proteínas específicas ao processo invasivo. Inicie com a transdução retroviral de células com a proteína fluorescente de interesse. Também crie a matriz tridimensional de proteína matrigel em inserts transwell e prepare uma suspensão celular na diluição apropriada.

Utilizando o sistema de transbem com Matrigel, meça a resposta de transmigração para o quimioatraente com drogas experimentais ou tratamentos e prossiga para visualizar e analisar a invasão celular por microscopia confocal. Em última análise, os resultados podem determinar a magnitude e o modo de invasão celular em uma matriz proteica tridimensional. O poder dessa técnica em comparação com métodos existentes, como o ensaio tradicional de invasão em Transwell, reside em sua capacidade de gerar dados tanto quantitativos quanto qualitativos sobre a invasão celular em uma matriz proteica tridimensional.

Minha colaboradora, Diane Creighton, demonstrará agora o método de cultura de células empacotadoras de retrovírus em DMEM contendo 10% de FBS por 48 horas. Transfete as células com DNA retroviral de acordo com as instruções do fabricante. Incube por 24 horas, lave os poços duas vezes com meio, adicione então 1,5 mililitro de DMEM com 10% de FBS por poço e incube por 48 horas para coletar o retrovírus empacotado.

Transfira o meio de cultura de tecidos para tubos de microcentrífuga de dois mililitros, centrifugue para sedimentar quaisquer células e colete o sobrenadante em um tubo limpo. Armazene este estoque de retrovírus a menos 80 graus Celsius. Agora, para células retrotransduzidas, remova o meio de uma cultura de uma noite e adicione um mililitro do estoque de retrovírus suplementado com poli-lisina.

Após uma incubação de seis horas, adicione dois mililitros de DMEM com 10% de FBS à placa e coloque as placas em um incubador a 37 graus Celsius. Após a noite, reponha o meio e, após 24 horas, adicione o meio seletivo apropriado; quando as células estiverem confluentes, recolha-as e selecione por fluorescência utilizando células não transduzidas como referência. Colete as células com fluorescência superior à das células não transduzidas e congele alíquotas a menos 80 graus Celsius para uso futuro.

Este método depende da expressão de proteínas fluorescentes para visualização e permite obter informações sobre as contribuições individuais das células. Coloque o gel de matriz completo sobre gelo e, em seguida, dilua-o na proporção de um para um em PBS frio. Agora, insira os transwell não revestidos em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços.

Em seguida, pipete cuidadosamente 100 microlitros de gel matri diluído nos poços e deixe solidificar a 37 graus Celsius. Enquanto isso, prepare as suspensões celulares marcadas com fluorescência no meio de crescimento normal. Quando o gel matri tiver solidificado, inverta os transbem e pipete 100 microlitros da suspensão celular na face inferior do filtro voltada para a saída.

Cubra cuidadosamente os transbem com a base de uma placa de cultura tecidual de 24 poços, fazendo contato com cada gota da suspensão celular. Incube a placa em posição invertida por quatro horas para permitir a adesão celular. Agora, vire as placas com o lado certo para cima e lave cada transbem mergulhando-o duas vezes em um mililitro de meio livre de soro.

Em seguida, posicione o transwell em um terceiro poço contendo quaisquer medicamentos ou reagentes de tratamento. O agente pipeta cuidadosamente 100 microlitros de meio contendo quimioatraente no transwell, acima da mistura solidificada de Matrigel e PBS. Incube por três a cinco dias a 37 °C com 5% de dióxido de carbono para obter imagens de células não fluorescentes invadindo o Matrigel.

Coloque os transwells em placas de 24 poços com meio fresco e pipete. Um mililitro de solução de cálcio AM quatro micromolar sobre cada tampão de matri gel, permitindo que escorra pelas bordas e marque pela parte superior e inferior. Incube por uma hora a 37 graus Celsius em atmosfera úmida com 5% de dióxido de carbono. Em seguida, visualize por microscopia confocal.

Este primeiro método de coloração vital permite a visualização dos modos de invasão. Transfira cada transwell para uma placa de 24 poços fresca, sobrepõe com um mililitro de paraformaldeído 4% contendo 0,2% de Triton X-100 e incube à temperatura ambiente por meia hora. Após três lavagens com um mililitro de PBS, adicione RNase A durante 30 minutos e, em seguida, lave duas vezes com PBS para visualização com 0,01 miligrama por mililitro.

Iodeto de propídio diluído em PBS e deixe em temperatura ambiente no escuro por 30 minutos. Lave três vezes com PBS. Nesta etapa, as câmaras de transmigração coradas com iodeto de propídio podem ser mantidas em temperatura ambiente no escuro por pelo menos um mês.

O segundo método de coloração celular exige fixação, mas permite uma quantificação mais rápida da invasão. Utilizando um microscópio confocal invertido, coloque o transwell com uma pequena quantidade residual de PBS sobre uma lamínula grande com objetivo não imersivo de 20 vezes e capture seções ópticas a cada 10 a 15 micrômetros a partir da base do tampão de matrigel. Quantifique o grau de invasão utilizando fatias ópticas individuais. Além disso, construa objetos tridimensionais utilizando um software apropriado, como o Velocity, nesta série de fatias ópticas, em que as células foram coradas com amarelo de cálcio.

Como esperado, o número de células que invadem a partir do filtro diminui com a distância. Essa invasão pode ser quantificada. Reconstruções tridimensionais da invasão celular oferecem uma representação visual do modo de invasão.

Se as células forem marcadas pela expressão de proteínas fluorescentes, as posições de cada célula colorida poderão ser visualizadas em reconstruções tridimensionais, como mostrado nesta vista lateral. Além disso, cortes através da reconstrução podem oferecer insights sobre mecanismos moleculares. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar este ensaio de invasão celular para obter mais informações sobre o processo evasivo do que as obtidas com os métodos padrão.