Imagem de cálcio funcional em desenvolvimento de redes Cortical

O objetivo geral deste vídeo é demonstrar como medir a atividade de rede em fatias cerebrais corticais em desenvolvimento utilizando um indicador fluorescente sensível ao cálcio. Fatias cerebrais DY são obtidas do córtex enteral em desenvolvimento de um camundongo jovem. Tanto os neurônios quanto os astrócitos são carregados com marcadores dependentes de cálcio.

Alterações na fluorescência de corantes dependentes de cálcio refletem mudanças na atividade celular. Células não neuronais, incluindo astrócitos, micróglias e células endoteliais, podem ser coradas utilizando corantes marcadores específicos. A atividade da rede cortical é registrada por meio de imagens com microscopia de múltiplos fótons com lapso de tempo; as células são detectadas dentro da rede mediante a obtenção de uma pilha tridimensional de imagens através da região de interesse.

As alterações na fluorescência celular em múltiplas células podem então ser analisadas para avaliar a atividade da rede cortical em desenvolvimento. Um padrão característico de atividade no sistema nervoso em desenvolvimento é a atividade espontânea sincronizada da rede. A atividade sincronizada tem sido observada em diversas regiões neuronais em desenvolvimento, incluindo o córtex da medula espinhal intacto e preparações de culturas neuronais dissociadas durante períodos de atividade espontânea, em que os neurônios, despolarizados para disparar, geram potenciais de ação únicos ou rajadas que ativam diversos canais iônicos, incluindo canais de cálcio ativados por voltagem, levando à entrada de cálcio.

Atividade altamente sincronizada tem sido medida em redes locais usando eletrodos de campo ou matrizes de múltiplos eletrodos. Esses métodos permitem altas taxas de amostragem temporal, mas oferecem menor resolução espacial devido à leitura integrada da atividade celular. A resolução em nível de célula única da atividade neural é possível por meio da eletrofisiologia com eletrodo de patch em neurônios individuais para medir as taxas de disparo.

No entanto, a capacidade de realizar medições a partir de uma rede é limitada ao número de neurônios submetidos simultaneamente a patch, sendo tipicamente apenas um ou dois neurônios. O uso de corantes fluorescentes indicadores dependentes de cálcio permitiu a medição da atividade sincronizada em uma rede de células. Esta técnica oferece alta resolução espacial e amostragem temporal suficiente para registrar a atividade espontânea da rede em desenvolvimento.

Indicadores fluorescentes sensíveis ao cálcio, como o éster URA 2:00 AM, contêm grupos ácido carboxílicos que são capazes de ligar íons cálcio. Esses corantes fluorescentes são ativados por comprimentos de onda específicos de luz, utilizando microscopia de um fóton ou de dois fótons. O número de fótons emitidos pelo corante é alterado temporariamente após a ligação com cálcio.

Essa alteração no número de fótons ou na fluorescência é relatada como o sinal delta FF e corresponde a uma alteração no nível de cálcio dentro do neurônio. A medição de alterações em indicadores sensíveis ao cálcio é uma medida útil de leitura dos padrões de atividade da rede em células em desenvolvimento. Olá, eu sou Rianna Morty, e meu nome é Julie Abbots.

Somos do Departamento de Neurofisiologia Interpretativa e da universidade em Amsterdã. Temos utilizado a imagem de cálcio para estudar a atividade funcional em tecidos em desenvolvimento na córtex de camundongos, empregando indicadores sensíveis ao cálcio em imagens multifocais. O objetivo deste breve vídeo é demonstrar como esses métodos podem ser usados para medir padrões de atividade espontânea e evocada em redes em desenvolvimento no sistema nervoso.

Remova rapidamente o cérebro do crânio de um camundongo jovem para reduzir danos à circuitaria neural. Disseque o cérebro em solução gelada para cortes. A solução para cortes contém cloreto de colina em vez do sódio comumente usado na A TSF para gravações neuronais.

Nestes experimentos, estamos preparando fatias cerebrais do córtex enteral do cérebro de camundongo em desenvolvimento. Coloque um pedaço de papel filtro sobre uma placa de petri e umedeça com alguns mililitros de A TSF. Transfira o cérebro para o pedaço de papel filtro.

Bissecte os hemisférios usando uma lâmina de barbear de borda única. Separe os dois hemisférios. Coloque um deles de volta na solução de corte gelada junto com o hemisfério restante.

Remova o cerebelo com a lâmina de barbear. Vire um hemisfério sobre sua linha média e faça um corte de aproximadamente um milímetro a partir da superfície dorsal, com um leve ângulo da lâmina em direção ao extremo rostral. Vire o cérebro para baixo sobre.

Sua superfície recém-cortada usando um bastão de algodão e uma espátula de metal. Transfira o cérebro para o bloco metálico de corte. Empurre suavemente o cérebro com o bastão de algodão, retirando-o da espátula e colocando-o sobre a superfície colada.

Fatias de cérebro de 300 micrômetros são cortadas; para tecidos jovens, as velocidades de corte e a frequência da lâmina são tipicamente mais baixas do que aquelas usadas para tecidos mais maduros. Após o corte, transfira cada fatia usando uma pipeta de vidro; as fatias são transferidas para a câmara de armazenamento, que contém A CSF oxigenado à temperatura ambiente. A A CSF contém uma proporção mais elevada de magnésio em relação ao cálcio do que a solução de A CSF.

Os cortes utilizados para gravação são deixados por uma hora para recuperação. Para carregar as células com um indicador dependente de cálcio ou marcador específico de célula, os cortes precisam ser transferidos para uma câmara para o procedimento de coloração. Embora câmaras comerciais estejam disponíveis, é possível montar facilmente uma a partir de equipamentos de laboratório padrão por um custo muito baixo.

Para montar uma câmara de coloração, você precisará do seguinte equipamento básico de laboratório: duas placas de Petri plásticas, uma seringa de 10 mililitros, um trecho de tubo de silicone, um inserto para cultura celular com membrana semipermeável, cola instantânea, três conectores pequenos para tubos e uma agulha fina. Pegue a placa de Petri grande e faça um pequeno orifício com uma haste aquecida na parede lateral. Pegue a placa de Petri pequena e faça um orifício de diâmetro semelhante, mas suficientemente grande para que o tubo de silicone possa passar através dele.

Passe um trecho de tubo de silicone através do orifício e forme um laço dentro do pequeno recipiente. Use cola super forte para selar a extremidade aberta do tubo. Em seguida, fixe o restante do tubo na parede interna do pequeno recipiente de Petri.

Coloque a pequena placa de Petri no centro da grande e fixe-a com cola. Pegue a extremidade restante do tubo de silicone e passe-o através do pequeno orifício na parede lateral da placa de Petri. Pegue uma agulha fina e faça pequenos orifícios no tubo de silicone dentro da placa de Petri.

Faça os orifícios em intervalos igualmente espaçados para uma fusão de gás uniforme. Tome um poço de cultura celular com uma membrana semipermeável usando um bisturi aquecido. Corte o topo de um centímetro do poço para deixar um recipiente raso que sustente as fatias durante a incubação.

Coloque o recipiente raso no centro do recipiente pequeno, cercado pelo tubo de silicone poroso. Faça um orifício com diâmetro aproximado de meio a um centímetro na tampa do recipiente grande. Pegue uma seringa plástica de 10 mililitros usando um bisturi aquecido.

Realize um corte em ângulo para remover a extremidade da seringa. Aplique cola instantânea na superfície cortada do tubo da seringa. Cole-o diretamente sobre o orifício na tampa da placa de Petri grande.

Conecte um conector de tubo à extremidade da ponta da seringa. Coloque o recipiente raso no centro do pequeno recipiente de Petri, garantindo que o tubo de gás poroso esteja disposto ao redor do recipiente. Esse tubo é então conectado a uma fonte de gás carbogênio para oxigenar as fatias.

Durante a incubação, substitua a tampa do recipiente grande, que também está conectada diretamente ao suprimento de gás através da ponta da seringa. Isso fornecerá um suprimento de ar e gás sobre as fatias durante a incubação, evitando o desbotamento do corante. Todos os procedimentos são realizados com a menor quantidade de luz possível, e tanto o corante quanto as fatias são mantidos no escuro.

Encha a câmara de coloração com aproximadamente um mililitro e meio de A TSF proveniente do suporte de fatias. Coloque a câmara de interface no interior e complete com mais um mililitro de A TSF. É importante manter um bom suprimento de oxigênio para preservar a viabilidade do tecido e garantir uma boa carga na fatia.

A coloração ocorre a aproximadamente 35 graus C para facilitar a captação do corante pelos neurônios enquanto a câmara de coloração está aquecendo. Prepare o corante indicador para fira 2:00 AM Ester. Adicione nove microlitros de DMSO com um microlitro de ácido ônico a um frasco de 50 microgramas.

DMSO e ácido ônico. Atuam como agentes permeabilizantes para permitir que o corante seja absorvido através da membrana lipídica. Agite o frasco em vórtex por 15 minutos para garantir que o corante esteja completamente dissolvido.

Para a coloração, transfira cada fatia para a interface. Insira na câmara de coloração. Aplique o corante diretamente na região de interesse acima das fatias e feche a tampa da câmara de coloração.

Deixe as fatias em incubação no escuro por 20 a 40 minutos, dependendo da idade do camundongo utilizado. Após a incubação, transfira as fatias de volta para o porta-fatias para remover qualquer corante em excesso remanescente. Os protocolos de coloração para imagem de cálcio também podem ser adaptados para tecidos mais velhos.

Isso exige uma etapa adicional de pré-incubação. Transfira as lâminas antigas para uma placa rasa de pré-incubação contendo três mililitros de LCR e oito microlitros de solução crema quatro a 0,5%. Aqueça a 35 graus C por três minutos. Em seguida, transfira as lâminas para a interface, insira na câmara de coloração e siga os procedimentos normais de coloração.

Também é possível corar essas fatias para células não neuronais, nomeadamente astrócitos, micróglias e células endoteliais. A ruminina de enxofre 1 0 1 pode ser usada para corar astrócitos para domínio de enxofre. Prepare uma solução de 10 micromolar e pipete o corante roxo sobre a região de interesse nas fatias.

Deixe em incubação por um período de 15 minutos. Transfira as fatias de volta para a câmara de armazenamento para remover qualquer corante em excesso. O conjugado FSE de lectina de tomate pode corar microglia e células endoteliais.

Para a lectina de tomate, prepare uma solução de 20 microgramas por mililitro. Aplique o corante sobre a região de interesse nos cortes. Deixe os cortes incubarem por um período de 45 minutos.

Em seguida, transfira novamente as fatias para a câmara de armazenamento. Durante a aquisição de imagens, as fatias precisam permanecer estáveis sob o microscópio. Normalmente, uma harpa metálica é posicionada para prender o tecido, no entanto, ela pode distorcer de maneira desigual a superfície da fatia, resultando em um campo de visão limitado em foco, o que deve ser evitado durante a imagem.

Essas fatias são fixadas na câmara de registro usando solução de POLYETHALINE ou PEI. O PEI é um polímero utilizado para melhorar a adesão de células a uma superfície por pelo menos uma hora. Antes de colocar as fatias nas câmaras de registro, encha essas câmaras com alguns mililitros de solução de PEI para cobrir o fundo da câmara.

Primeiramente, remova o PEI da câmara com água destilada, seguido por uma solução de CSF trans. Transfira uma fatia para a câmara de registro e remova o excesso de solução de CSF. Posicione a fatia no centro da câmara utilizando um pincel fino.

Remova todo o CSF adicional usando pequenos pedaços de papel filtro absorvente. Tenha cuidado para garantir que a fatia não tenha mais CSF ao redor das bordas. Por fim, adicione suavemente meio mililitro de CSF sobre a fatia sem desprendê-la da câmara.

Coloque as câmaras em um recipiente grande com interface oxigenada e deixe por mais uma hora no escuro. As alterações nos corantes indicadores sensíveis ao cálcio podem ser registradas com microscopia de um ou dois fótons. Utilizamos um laser de titânio-safira acoplado a um microscópio Olympus para permitir a imagem de dois fótons em nossas redes neuronais.

Além disso, utilizamos um sistema de escopo de corte da L Vision Biotech com câmera EM CCD hammer MATSU para aumentar as taxas de varredura de quadros. Posicione a câmara de fatias sob o microscópio com um fluxo estável de A-T-S-F-A-T-S-F oxigenado contendo 1,6 milimolar de cálcio e 1,5 milimolar de magnésio. O meio é aquecido a aproximadamente 30 graus C na configuração utilizando luz branca.

Localize a região de interesse na fatia e foque na superfície. Desligue as luzes e feche a porta do gabinete de gravação. Para reduzir os níveis de luz de fundo.

Muitos pacotes de software comerciais ou abertos diferentes estão disponíveis para gravar e analisar imagens. Em nosso laboratório, utilizamos o software Inspector da Lavis Biotech. Para iniciar a aquisição de imagens, selecione o modo da câmera CCD para detecção. Ajuste o comprimento de onda relevante para o seu indicador.

Para a aquisição às 2:00 AM Ester, defina a excitação em 820 nanômetros no software do escopo de ajuste. Selecione o modo de varredura 64 B. Escolha o tamanho ideal do campo de visão e a resolução de pixel para sua região de interesse.

Selecione uma taxa de quadros apropriada e a rotação de pixels, se necessário, para sua amostragem de imagem. Abra o obturador do laser para iniciar a aquisição contínua de imagens. Utilizando o modo de imagem contínua.

Ajuste o ganho e a intensidade do laser e foque na rede neuronal que deseja imaginar. Pare a varredura. Selecione as configurações de lapso de tempo para a taxa de quadros e a duração da sequência.

Após a aquisição de imagens com lapso de tempo, faça uma pilha Z de imagens marcando 20 micrômetros acima e 20 micrômetros abaixo em intervalos de um micrômetro. Essa pilha Z é utilizada para detecção celular durante a análise. Exporte os arquivos gravados como uma pilha de imagens TIFF.

Para concluir, demonstramos o uso de indicadores de cálcio para medir a atividade espontânea sincrônica em rede no córtex em desenvolvimento. Mais detalhes sobre a metodologia e os reagentes podem ser encontrados nas fichas técnicas que acompanham este vídeo, permitindo que você implemente a técnica em seu próprio laboratório.