Análise Quantitativa de Migração aleatória de células usando microscopia de lapso de tempo vídeo

O objetivo geral do experimento a seguir é medir quantitativamente a migração de células em tempo real utilizando microscopia de lapso de tempo em vídeo. Isso é conseguido primeiro revestindo uma placa de cultura de seis poços com colágeno e, em seguida, semear escassamente as células de interesse sobre a placa revestida. Como segundo passo, cria-se uma ferida na placa usando a ponta de uma pipeta, garantindo espaço suficiente para a migração.

Em seguida, o microscópio é montado e as imagens são capturadas em intervalos regulares utilizando um sistema de controle de temperatura para permitir o monitoramento contínuo das células migratórias em tempo real. Por fim, o protocolo de rastreamento de partículas é utilizado para avaliar as diferenças na velocidade média e no deslocamento total das células de teste e controle. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o ensaio de migração em câmara evitativa, é que ela não se baseia em medidas quantitativas de migração em ponto final.

Em vez disso, permite o monitoramento e o cálculo contínuo de diferentes parâmetros. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biologia do câncer, como, por exemplo, como determinados genes ou fármacos afetam a migração de células tumorais? Dois dias antes do procedimento, adicione 1,5 mililitros de colágeno diluído em meio opti a cada poço de uma placa de cultura de seis poços e, em seguida, incube a placa durante a noite a quatro graus Celsius um dia antes do procedimento.

Resuspenda as células de interesse em dois mililitros de DMEM acrescido de soro bovino fetal por poço e transfira as células para cada poço da placa revestida com colágeno ENC, incubando as células durante a noite a 37 graus Celsius. No dia do procedimento, utilize a ponteira de uma pipeta para criar uma ferida nas células cultivadas durante a noite e lave cada poço com PBS para remover qualquer debris formado em decorrência da ferida.

Adicione DMEM mais FBS aos poços lavados e, em seguida, verifique ao microscópio para confirmar que um espaço limpo de ferida foi criado. Após ligar a câmera do microscópio e o equipamento de imagem celular em tempo real, posicione a placa sobre a platina do microscópio. Cubra a placa com a nova câmara de controle ambiental para células vivas e ajuste o termostato para 37 graus Celsius e o dióxido de carbono para 5%. Agora abra o software slide book na barra de menu.

Selecione o controle de foco clicando no botão F dentro de um círculo. Na caixa do objetivo, use a janela suspensa para definir o objetivo. Na caixa do conjunto de filtros, selecione as configurações para direcionar o caminho da luz até a peça I. Selecione o filtro apropriado para Iluminação em Campo Claro e, em seguida, clique em Abrir Campo Claro.

Para abrir o obturador de campo claro. Agora, selecione o filtro de campo claro na torreta e visualize a amostra através da ocular para encontrar os campos apropriados e focalizar a amostra. Em seguida, mova a torreta de filtros para alterar o trajeto da luz para a câmera. Para captura de imagem no software slide book, clique em controle de foco, selecione XY para escolher diferentes posições através da ocular, e então clique em definir ponto para fixar cada localização.

Para a captura da imagem, ajuste manualmente o foco da imagem da câmera visualizada na tela e, em seguida, utilize as ferramentas na janela de controles de foco para ajustar a posição Z da platina. Para obter os melhores resultados, foque em projeções celulares planas próximas ao contato com a placa, o que auxilia no foco. Use o controle deslizante para ajustar os tempos de exposição a uma faixa apropriada para o foco.

Se várias posições XY foram selecionadas, ajuste o foco para cada posição individual selecionando o controle de foco. Depois, xy e, em seguida, visite o ponto. No slide book, selecione o ícone da câmera na barra de menu, selecione o tipo de captura e, então, lapso de tempo para definir a duração do experimento.

No menu suspenso, digite o atraso desejado entre o início de um ponto temporal e o início do próximo. Nos campos de intervalo, o terceiro campo será calculado automaticamente a partir dos valores inseridos manualmente. Em captura XY múltipla, selecione a lista de múltiplos pontos para experimentos com mais de uma posição XY.

Por fim, nomeie o arquivo para salvá-lo, vá até o controle de captura e selecione avançado, depois spool. Em seguida, capture na memória e salve no arquivo spool após cada ponto temporal. Comece clicando em imagem.

No menu da barra do slide book, selecione importar no menu suspenso e, em seguida, clique em spool do slide book. Selecione os arquivos desejados do slide book gerados a partir do experimento de migração para diversos campos e pontos de tempo. Abra o primeiro arquivo, depois selecione máscara na barra de menu e escolha o protocolo de rastreamento de partículas no menu suspenso.

No menu de rastreamento de partículas, escolha o protocolo de rastreamento manual de partículas. Uma janela aparecerá com os pontos de tempo inicial e final. Para analisar a migração aleatória, selecione a máscara e, em seguida, o protocolo de rastreamento de partículas. Novamente, para determinar as coordenadas do centro do objeto, selecione centro da área.

Em seguida, clique em rastrear e continuar. Agora, escolha as estatísticas desejadas para cada trajetória, como deslocamento e velocidade média. Como mostrado aqui, clique em calcular para visualizar as estatísticas.

Um exemplo de análise de migração aleatória quantificada em termos de velocidade é mostrado nesta caixa. No gráfico de whiskers, neste experimento, houve um aumento na velocidade média em células M-D-A-M-B 2 31 com o gene supressor de tumor silenciado. Em comparação com as células M-D-A-M-B 2 31 controle aqui apresentadas, a migração aleatória das células da primeira figura foi analisada em termos de deslocamento celular.

Novamente, o grupo com supressão gênica total de genes supressores de tumor apresentou um aumento no deslocamento celular em comparação com o controle M-D-A-M-B 2 31. As células neste controle de microscopia de vídeo com lapso de tempo, células MDA MB 2 31, foram semeadas sobre colágeno durante a noite. As imagens foram então obtidas em intervalos de uma hora, durante um total de 18 horas, durante a migração aleatória.

Observe como as células se afastam de suas posições originais ao longo do tempo. Neste filme, a migração de células teste M-D-A-M-B 2 31 após semeadura noturna em colágeno foi registrada e analisada. Observe que as células teste são mais migratórias em comparação com as células controle do filme anterior.

Após este procedimento, outros métodos como invasão celular e dynas podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como: quais são os papéis das células na metástase do câncer após seu desenvolvimento? Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia celular explorarem a migração celular utilizando linhagens celulares cancerígenas isoladas.