Mapeamento de Difusão Molecular na membrana plasmática por Multiple-Target Tracing (MTT)

Olá. Neste vídeo, apresentamos um experimento completo de rastreamento quântico único. Um algoritmo dedicado foi inteiramente concebido em colaboração com especialistas em imagem do ISIS. Durante este vídeo, utilizaremos o receptor do fator de crescimento epidérmico como modelo para descrever o método dessa técnica.

O receptor do fator de crescimento epidérmico é uma proteína transmembranar. Este receptor será marcado utilizando um anticorpo monoclonal, que é reduzido para manter apenas o fragmento A a B. O fragmento A a B é biotinilado e, posteriormente, ligado à estreptavidina do ponto quântico, de modo que o sistema completo reconhecerá com precisão o receptor de EGF.

Nosso objetivo é fornecer uma visão abrangente da dinâmica dos receptores da superfície celular. De fato, as trajetórias moleculares podem se desviar da difusão browniana ao serem confinadas em nano-domínios. Por exemplo, isso pode ser um indicativo de uma interação subjacente com, por exemplo, parceiros de sinalização ou estruturas moleculares de sustentação.

Objetivamos descrever exaustivamente tais eventos mapeando-os ao longo da célula, o que exige trabalhar com alta resolução temporal SPECT juntamente com alta densidade de marcação. Denominamos, portanto, esta abordagem de rastreamento múltiplo de alvos. O primeiro passo do experimento é a preparação da amostra.

Trabalhamos com células vivas com e sem antibióticos. Aqui utilizamos sete células, que expressam endogenamente receptores de EGF. Após destacar a célula, precisamos confirmar com exatidão para ter o mesmo número de células por poço da placa.

Um número preciso de células é muito importante para aumentar a previsibilidade do número de pontos quânticos por célula. Após dispensar a célula no poço H, é necessário incubá-la por 24 horas a 37 graus com 7% de CO2. O próximo passo é a preparação dos pontos quânticos conjugados a anticorpos. Pontos quânticos são nanopartículas fluorescentes pequenas.

Essas partículas têm um interesse muito grande aqui porque são muito brilhantes e estáveis em comparação com sondas fluorescentes clássicas e seus sinais. A razão sinal-ruído é muito importante para este tipo de experimento. Neste caso, usamos meio completo para saturar os locais ao redor dos pontos quânticos e prevenir agregação.

Após isso, tivemos os pontos quânticos na proteína bioTE eluída ou em anticorpos de interesse em uma proporção de um para um, a fim de obter estatisticamente mais pontos quânticos monovalentes. Neste experimento, utilizamos um fragmento F(ab')₂ contra o receptor de EGF produzido em laboratório a partir de anticorpos monoclonais e que são marcados com biotina. Durante a incubação de aproximadamente 15 minutos, você pode manter o controle contra agregação e manter a homogeneidade utilizando um agitador a 1.200 rotações por minuto e 25 graus.

Quando a mistura estiver pronta, você pode adicioná-la às suas células. Remova o meio do poço com muita suavidade para evitar a dessanexação celular na equipe de laboratório e adicione a quantidade necessária de mistura para o seu experimento. Neste caso, adicionaremos 100 microlitros de mistura por poço.

Após a adição da mistura, você pode incubar sua célula por 15 minutos. Neste caso, a 37 graus com 7% de CO2. Após esta incubação, você pode encontrar um grande número de pontos gêmeos frequentes em suspensão no meio.

Esses pontos quânticos devem ser removidos antes da imagem. Por causa do ruído que introduzimos. É por isso que precisamos lavar cada um, bem, várias vezes neste caso, cinco vezes para se lavarem.

Utilize um meio de imagem sem autofluorescência. Aqui, usamos tampão HBSS com aps. Agora suas células estão prontas.

Está na hora de ir para a configuração para a aquisição. A configuração é composta por quatro partes principais: um microscópio invertido, uma câmera com sensibilidade ao olho, uma lâmpada de mercúrio potente e um incubador para manter as células a 37 graus. A luz da lâmpada de mercúrio passa por uma fibra e por uma roda de filtros antes de iluminar a amostra.

A fluorescência da amostra é filtrada e coletada por uma câmera E-M-C-C-D à esquerda. Atualmente, utilizamos objetivas com abertura numérica de 1,3 e 1,49 em óleo. O passo central deste experimento é a aquisição em si.

Uma vez que as células estão em foco, observamos uma célula representativa com marcação intensa. Em pontos quânticos, adquirimos inicialmente uma única imagem em luz branca transmitida, que pode ser posteriormente utilizada para verificar a morfologia celular e o limite especial dos podia LA. Em seguida, adquirimos um vídeo tipicamente com taxa de 36 milissegundos, a taxa mais rápida permitida no quadro completo.

Utilizamos um CCD com multiplicação eletrônica para alcançar sensibilidade em nível de molécula única com uma relação sinal-ruído suficiente, pelo menos acima de 20 decibéis. Normalmente em torno de 25 decibéis, geralmente adquirimos 300 quadros. Para avaliar um conjunto de dados específico, você precisa apenas fornecer o caminho para o diretório que contém os arquivos de vídeo.

Em seguida, digitando o comando, o texto se reconecta no MetLab ou no comando MTT 23 I, que inicialmente exibe uma interface gráfica com lista. Todos os parâmetros utilizados iniciarão a análise totalmente automatizada. A análise principal do MTT é realizada em cada quadro, invocando três tarefas principais: primeiro, a detecção em cada pixel quanto à presença ou ausência de uma dívida quântica do alvo.

Em seguida, para cada detecção, a estimativa dos parâmetros relevantes do alvo, como sua posição em pixels, intensidade do sinal, e assim por diante. Por fim, a reconexão dos novos alvos com as trajetórias já construídas ao longo dos quadros anteriores para cada pixel.

Considerando uma sub-região local, comparamos duas hipóteses de presença: apenas ruído ou a presença de um sinal. Com a função de espalhamento do ponto, o ModuLite apresenta um pico agudo. Utilizamos um limiar que garante poucos alarmes falsos, com menos de um alarme por detecção por quadro para cada alvo detectado.

Em seguida, realizamos um ajuste mínimo-quadrado de picos fantasmas para estimar a posição, largura e altura dos Goshen detectados. Isso fornece notavelmente a posição espacial da molécula marcadora, tipicamente com precisão de 10 a 20 nanômetros para razões sinal-ruído usuais. Em densidades elevadas, os picos frequentemente podem estar muito próximos, e picos mais fortes podem dificultar a detecção dos mais fracos. Para lidar com isso, realizamos a deflação dos picos detectados a partir da imagem inicial.

Novamente, a detecção no residual pode tipicamente ressaltar 10% dos picos. Alcançar uma detecção quase exaustiva é muito proveitoso para uma reconexão precisa. Em seguida, o conjunto de novos alvos é associado ao conjunto de traços anteriores para esta pupila.

Para atribuir cada trajetória a um alvo, sempre que possível, e para lidar com possíveis intermitências, utilizamos todas as informações estatísticas disponíveis obtidas na etapa de detecção. Assim, os alvos não são simplesmente atribuídos à trajetória mais próxima. Em caso de conflitos, quando trajetórias podem se cruzar, o que significa que as respectivas regiões relevantes de pesquisa se sobrepõem, consideraremos os valores estatísticos de intensidade, velocidade, largura e intermitência tanto para as trajetórias quanto para os alvos.

Isso fornece a pontuação de reconexão estatisticamente ótima. A estratégia permite evitar, sempre que possível, o viés da reconexão em direção aos vizinhos mais próximos, ou seja, ao movimento mais lento. Em seguida, utilizamos uma função para avaliar possíveis confinamentos transitórios dentro das trajetórias.

Essa função é inversamente relacionada à difusão local, conforme estabelecido por Sexton Simpson e colaboradores. A aplicação de um limiar permite definir episódios confinados ou não. Ao iterar esses traços no conjunto, podemos finalmente mapear a dinâmica da membrana em termos de confinamento transitório, evidência de desaceleração, e isso pode ser representado.

Alternativamente, utilizando os valores binários ou discretos desse índice de confinamento, por padrão, o MTT realizará automaticamente essas tarefas, salvando para cada vídeo os parâmetros de linha para cada pico em um arquivo eski, e para investigações avançadas posteriores. Resultados típicos, como o mapa de trajetórias sobre cada célula e histogramas de parâmetros de interesse, intensidades dos picos, razão sinal-ruído, valores locais deficientes, e assim por diante, podem ser facilmente adaptados a qualquer investigação específica. Este vídeo agora resumirá os resultados típicos obtidos pelo MTT.

Uma parte substancial do trabalho reside na elaboração do algoritmo, que pode precisar ser adaptado a investigações específicas, como os modos de movimento ou interações. Mas executar o MTT é muito simples. Os usuários devem apenas otimizar alguns parâmetros, como os limites de espaço e tempo.

Ao elaborar o MTT, nosso objetivo foi reconsiderar completamente as opções analíticas utilizadas para cada tarefa. Otimizamos o processo ao longo de dois eixos desafiadores. Primeiro, lidar com altas densidades para obter a melhor informação espacial possível sobre a superfície, e segundo, tratar baixas relações sinal-ruído (SNR), o que normalmente permite trabalhar com baixa eliminação e alta velocidade; o confinamento pode ser interpretado como a assinatura de uma interação subjacente.

Receptores de membrana podem interagir com o citoesqueleto submembranar ou domínios pró-lipídicos, por exemplo. Tais eventos podem ser investigados por meio de variações de confinamento no espaço e no tempo. Medidas dinâmicas podem ser comparadas a abordagens complementares, como FRA F Cs ou freight.

O código aberto está disponível para pesquisa acadêmica. Pode ser baixado em nossa página web no CML ponto univ if an S fr na página de nossas equipes, que fornece um link para download. Industriais interessados também são bem-vindos para entrar em contato conosco.

Gostaríamos de agradecer especialmente aos membros da nossa equipe e das instalações compartilhadas pelo apoio e pelas discussões produtivas. Este projeto é financiado por recursos do CNRS na c MAA University Pac Region National de La, e a Fundação Médica é apoiada pelo controlador da liga. Obrigado por assistir.