Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um método simples e reprodutível de esmagamento do nervo ciático e análise em montagem inteira da reinervação muscular após a lesão do nervo ciático. Isso é realizado primeiramente expondo o nervo ciático, incluindo a adequada disposição dos retratores cirúrgicos para garantir bom acesso ao nervo. Em seguida, esmaga-se o nervo com pinça hemostática e marca-se o nervo com carvão vegetal.

Em seguida, remova os músculos individuais inervados pelo nervo ciático da pata traseira. O passo final é dissecar os músculos individuais para análise em preparação total após imunomarcação. Em última instância, os resultados demonstram que a compressão reprodutível do nervo ciático pode ser realizada de forma simples e que preparações em lâmina total de músculos podem ser utilizadas para analisar a regeneração subsequente.

A principal vantagem deste procedimento é que ele fornece uma técnica simples e reprodutível para esmagar o nervo ciático e, posteriormente, avaliar a regeneração axonal. Inicie este procedimento anestesiando o camundongo para cirurgia usando uma cocktail de 100 miligramas por quilograma de cetamina e 10 miligramas por quilograma de xilazina por injeção intraperitoneal para minimizar a dor pós-operatória. O camundongo também recebe uma injeção subcutânea de 10 miligramas por quilograma de meloxicam.

Em seguida, depile cuidadosamente ambos os flancos usando uma tesoura cirúrgica. Então, aplique creme depilatório nasal para esgotamento completo. Limpe a pele com um aplicador estéril com ponta de algodão e anti-séptico cirúrgico de Betadine.

Após isso, aplique pomada oftálmica nos olhos com um aplicador estéril com ponta de algodão. Coloque o camundongo sobre uma placa de aço inoxidável limpa sobre uma manta térmica homeostática pré-aquecida e mantenha a temperatura do animal em 37 graus Celsius. Em seguida, fixe todas as patas com fita adesiva.

Posicione cuidadosamente o membro traseiro de forma simétrica, de modo que a articulação do joelho forme um ângulo reto com o corpo. Posteriormente, cubra o campo cirúrgico com um campo estéril sob o microscópio. Faça uma incisão semicircular atravessando a linha média.

Se pare a pele suavemente da musculatura subjacente e dobre-a de tempos em tempos. Aplique cerca de 0,1 mililitros de solução salina estéril para manter o local cirúrgico úmido durante o procedimento. Em seguida, abra o plano fascial entre o glúteo máximo e a cabeça anterior do bíceps femoral.

Para expor o nervo ciático como controle cirúrgico. O nervo ciático contralateral deve ser exposto e mobilizado, mas mantido intacto. Em seguida, reposicione e sutura a musculatura glútea.

Exponha o nervo ciático experimental da mesma maneira com afastadores. Para facilitar a visualização. Libere suavemente o nervo ciático do tecido conjuntivo ao redor utilizando uma tesoura de iridectomia.

Em seguida, use a pinça fina 5 45 para posicionar o nervo na mandíbula inferior da pinça hemostática super fina, alinhando os três fascículos adjacentemente, não um sobre o outro. A pinça hemostática possui uma marca gravada a 1,5 milímetros de sua ponta. Posicione a porção mais externa do isquiático alinhada com essa marca antes da compressão.

Isso garante uma prensagem de largura uniforme e que o nervo não se estenda além das hastes da pinça hemostática quando achatado devido à força de prensagem. Se o nervo se estender além das pontas da pinça, ele será apenas parcialmente esmagado. Utilize um segundo par de pinças hemostáticas previamente mergulhado e polvilhado com carbono para marcar o local da prensagem.

Esmague o nervo no mesmo local de esmagamento por 15 segundos com três cliques. Nenhuma marcação com carvão deve ultrapassar o limite do esmagamento inicial. Isso é particularmente importante se for necessária uma marcação precisa do local de esmagamento, devendo-se mergulhar previamente a pinça no carvão para evitar a disseminação do carvão no local cirúrgico.

Abra a pinça no carbono em pó. Em seguida, feche-a suavemente. Use gaze estéril para remover o carbono da parte externa da pinça hemostática.

Verifique a pinça sob ampliação de pelo menos três vezes para confirmar que as superfícies de compressão estão uniformemente revestidas com carbono em pó. Se necessário, mergulhe novamente e limpe. Reponha e sutura a musculatura glútea da mesma maneira que no lado contralateral. Por fim, feche a incisão na pele utilizando clipes reflexos de nove milímetros.

Se os grampos reflexos de nove milímetros forem considerados restritivos ao movimento, podem ser utilizados grampos reflexos menores ou seis suturas aut. Em vez disso, após sacrificar o camundongo, remova quatro músculos: o tibial anterior, o extensor longo dos dedos, o perônio longo e o sóleo da perna traseira, com cuidado, fixando-os através dos seus tecidos conjuntivos a um recipiente revestido com sard preto.

Em seguida, lave-os em PBS. Posteriormente, fixe-os em paraformaldeído a 4% por 30 minutos. Para dissecar cada músculo em uma placa de Petri revestida com papel preto, remova os tendões com a tesoura de iridectomia.

Em seguida, adelgaçe os músculos removendo cuidadosamente as fibras musculares internas. Preserve com cuidado a superfície externa do músculo, incluindo as faixas da placa motora. Em seguida, monte os músculos resultantes em lâminas com vetor de proteção e lamínulas de vidro de 22 por 40 milímetros, selando dois lados com esmalte incolor. Quando corretamente montados na lâmina, as faixas da placa motora devem estar em contato com as lamínulas.

Aqui temos um exemplo de um local de esmagamento in loco na extremidade esquerda da pata traseira. O local de esmagamento é indicado pelo carbono preto. O asterisco marca um ramo do nervo tibial que inerva a musculatura da coxa e serve como um marco anatômico útil.

Durante a cirurgia de esmagamento, a divisão tibial do nervo ciático é destacada em azul, a peroneal em verde e a sural em amarelo. Esta seção semifina demonstra um esmagamento completo realizado com pinça hemostática. As setas indicam as fibras esmagadas aqui.

Uma compressão incompleta realizada com pinça angular é indicada em outra seção de semi-fin. As pontas de seta indicam novamente fibras comprimidas, enquanto as setas indicam axônios preservados. Estas são as imagens renderizadas dos músculos em montagem inteira.

Após a remoção do tecido conjuntivo e posterior afinamento, as faixas da placa motora são delineadas em cada músculo. É mostrado aqui o músculo inteiro em preparação de sous. 14 dias após a esmagamento do nervo ciático.

As setas indicam áreas da junção neuromuscular que foram reinnervadas por um axônio. Aqui está a demonstração de uma junção neuromuscular desnervada. Os processos de células de Schwann positivos para gap 43 são indicados pelas cabeças de seta.

Nenhum axônio é observado nesta junção neuromuscular desnervada. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como esmagar de forma reprodutível o nervo estático e preparar lâminas de músculo com hormônio para a análise da regeneração.