Microcápsulas de alginato como uma plataforma 3D para Propagação e Diferenciação de Células-Tronco Embrionárias (hESC) para diferentes linhagens

Este protocolo é otimizado para encapsular células-tronco embrionárias humanas pluripotentes e diferenciá-las em neurônios dopaminérgicos em um sistema 3D. Primeiro, trate as colônias com inibidor de ROCK ou RI e dissocie-as em células individuais com acuato misturado com alginato de sódio e passe pela dispositivo de encapsulação. Continue o tratamento com RI por três dias, transfira as células encapsuladas para placas PA seis e diferencie por 28 dias.

Por fim, a análise da expressão gênica e proteica mostra uma eficiência maior na geração de neurônios dopaminérgicos. A principal vantagem dessa técnica específica em comparação com o protocolo de diferenciação 2D existente é que tentamos propagar e diferenciar essas células em um ambiente 3D, e esse ambiente 3D oferece a oportunidade de propagar as células de maneira altamente densa. Além disso, também proporciona melhores interações entre células durante a diferenciação.

E, em terceiro lugar, oferecer maior eficiência de diferenciação ao longo do processo. Além disso, se me permite acrescentar, essa técnica específica também pode ser adaptada para outros tipos de células que possamos propagar em um ambiente tridimensional. Lembre-se também, por exemplo, de que essa técnica em particular foi otimizada com base no uso de um inibidor específico de rock, que evita a apoptose celular e também previne a dessanexão das células dos recipientes de cultura.

Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades no início, pois esta técnica normalmente não é realizada em cultura de tecidos. A seguinte técnica de encapsulação foi otimizada com base nos estudos resumidos pelo Dr. Dean Dr. Chad sobre a aplicação do tipo de alginato inibidor R, concentração de alginato e configurações do dispositivo de encapsulação. Jamie e Kim, um estudante de doutorado do nosso laboratório, demonstrarão agora este protocolo.

Adicione 25 mililitros de solução estéril de gelatina a 0,1% a 275 miligramas de alginato de sódio purificado em um tubo estéril de 50 mililitros e vortexe para dissolver parcialmente o pó de alginato. Em seguida, coloque o tubo em um misturador orbital a 10 vezes G durante a noite. Depois, adicione cloreto de sódio estéril a 9% à solução de alginato.

Vortexie por 30 segundos e, em seguida, centrifugue a 95 vezes G durante cinco minutos. Armazene a solução de alginato a quatro graus Celsius. Primeiro, em um ambiente escuro, faça o pré-tratamento das células-tronco embrionárias humanas com meio de cultura suplementado com 10 micromolares de inibidor de ROCK.

Incubar por duas horas a 37 graus Celsius. Agora, lavar as células duas vezes com DPBS para destacar as células enzimaticamente. Adicionar accutase e incubar por 10 minutos.

A 37 graus Celsius, colete suavemente as células com um raspador celular e transfira para um tubo de 15 mililitros. Neutralize o Accutase com um volume igual de meio SL. Em seguida, passe as células neutralizadas através de um filtro de 40 mícrons para um tubo cônico de 50 mililitros estéril.

Agora, utilize um citômetro de hemácias para enumerar as células. Peliculize as células por centrifugação, descarte cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, lave as células uma vez com meio pré-aquecido.

Cloreto de sódio 0,9%. Centrifugue o seu ganho e descarte o sobrenadante. Para encapsular as células-tronco embrionárias humanas, comece por ressuspender as células com solução de alginato pré-aquecida.

Para fazer isso, acople uma seringa de 20 mililitros a uma tubulação de plástico macio e aspire a alginato para dentro da seringa. Em seguida, misture suavemente a suspensão celular usando a seringa, sem formar bolhas. Agora, aspire as células para dentro da seringa.

Descarte o tubo plástico e, em seguida, acople a seringa à máquina de encapsulação. Prossiga com a configuração dos instrumentos do gerador de microesferas, bomba de seringa, medidor de fluxo de ar e banho de precipitação de cloreto de cálcio. Verifique uma distância de 10 centímetros entre a extremidade da máquina de encapsulação e o ponto de coleta na placa de Petri.

Em seguida, ajuste a bomba de seringa em 10 mililitros por hora. Fluxo de ar a oito litros por minuto e uma pressão de 100 quilopascal. Colete as células encapsuladas em um banho de precipitação pré-aquecido por sete minutos.

Em seguida, transfira-os por aspiração suave para um tubo de centrífuga de 50 mililitros contendo 20 mililitros de cloreto de sódio 0,9%, deixe as cápsulas sedimentarem no fundo do tubo, descarte cuidadosamente o sobrenadante e lave uma vez com cloreto de sódio 0,9%. Prossiga com a ressuspensão das células encapsuladas em meio de cultura pré-aquecido, suplementado com inibidor ROCK. Transfira para um frasco de cultura e incube por três dias.

Plante as células da linhagem estromal de camundongo PA six em um frasco T75 revestido com gelatina a 0,1% e condicione o meio de diferenciação neural dopaminérgica por 24 horas. Transfira as cápsulas para um tubo cônico de 50 mililitros e deixe-as sedimentar no fundo do tubo. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as cápsulas no meio de diferenciação neural dopaminérgica condicionado pelas células PA six.

Cultura de meio. As células-tronco embrionárias humanas encapsuladas com a monocamada de células PA6 por 21 dias. Ao repor o meio, troque o meio de cultura.

Apenas metade do meio, a cada vez, é mantida para continuar o cultivo das células PA6 na diferenciação neural dopaminérgica. O meio é suplementado com fatores indutores por uma semana. Primeiro, aspire as cápsulas e transfira-as para um tubo cônico de 15 mililitros.

Quando as cápsulas se depositarem no fundo, descarte o sobrenadante. Lave duas vezes com DPBS, descartando o sobrenadante. Em seguida, adicione cinco mililitros de solução decap ululante e homogeneíze bem a suspensão.

Incube por cinco minutos à temperatura ambiente. Após centrifugar o pellet, remova as células decap e lave duas vezes com DPBS; em seguida, prossiga utilizando as células decap como cultura de monocamada ou para análise imediata a montante. Em um preparo típico, o diâmetro dos microcápsulos de alginato varia entre 400 e 500 micrômetros.

Aqui, ensaio C-F-D-A-P-I. Os resultados determinam as células encapsuladas viáveis verdes em 80%. Análises de viabilidade, proliferação e apoptose de células-tronco embrionárias humanas encapsuladas em diferentes pontos temporais servem para otimizar as condições de cultivo. Curiosamente, os efeitos do inibidor de rock previnem a apoptose induzida por dissociação e mantêm a viabilidade celular, com indicação de crescimento superior de células-tronco embrionárias humanas encapsuladas cultivadas em H-F-F-C-M mais ri.

Este exemplo aplica a encapsulação celular como uma plataforma tridimensional para diferenciar células-tronco embrionárias humanas encapsuladas em neurônios dopaminérgicos. Como esperado, o tamanho dos corpos embrionários aumenta com o tempo; após dois a três dias de cultivo, as células demonstram morfologia neuronal progressiva, com viabilidade superior a 90%. A análise de expressão gênica indica uma repressão do marcador de pluripotência OCT4.

É importante destacar que o marcador de progenitores neurais PAC seis e o marcador neuronal dopaminérgico th permanecem superexpressos após sete dias de diferenciação. Células-tronco embrionárias humanas diferenciadas mais amplamente indicam mais de 90% de neurônios positivos para TH após 21 dias. A análise de western blot confirma os padrões favoráveis de expressão de TH e PAC seis em sistemas de cultivo celular 3D em comparação com sistemas 2D.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada efetivamente em duas horas. Lembre-se de tratar as células com inibidor de rock antes e depois da encapsulação. Indutores ou inibidores variantes podem adaptar o protocolo de diferenciação tridimensional para experimentos futuros.

Esta técnica específica de encapsular ESL humanas e diferenciá-las em um ambiente tridimensional possui potencial para terapia celular em diversas doenças, particularmente na doença de Parkinson.