Avaliação da GFP Expressão e Viabilidade Usando o Tali Citómetro Baseado na Imagem

Este vídeo demonstra um procedimento para determinar a viabilidade celular em células que expressam GFP utilizando o citômetro baseado em imagem tally. Células transduzidas com GFP são coradas usando o kit de viabilidade tally para células mortas (dead cell red), que cora todas as células mortas de vermelho com iodeto de propídio; as células são transferidas por pipetagem para uma lâmina de análise celular tally e inseridas no citômetro, que adquire e analisa imagens de campo claro e de fluorescência vermelha e verde. Em seguida, são gerados histogramas para exibir a contagem celular, tamanho celular, intensidade de fluorescência de PI e intensidade de fluorescência de GFP, quando comparados à citometria de fluxo tradicional.

O Tali pode fornecer dados semelhantes sobre viabilidade celular e expressão. No entanto, essa citometria baseada em imagens fornece informações visuais adicionais sobre a população celular em análise. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência, é que o citômetro baseado em imagens Tali fornece simultaneamente informações quantitativas e visuais sobre sua amostra celular.

Além disso, o instrumento de contagem é mais fácil de usar, é menos caro e tem uma pegada menor do que um citômetro de fluxo ou um microscópio de fluorescência. Isso permite que os pesquisadores realizem rapidamente ensaios quantitativos, como viabilidade em células que expressam GFP, diretamente na bancada. Neste procedimento, células U2 OS numa concentração de um vezes 10 à sexta células por mililitro foram transduzidas com um construto viral GFP CellLight com alvo nuclear para manter as células mortas com iodeto de propídio; transfira 100 microlitros da suspensão celular para um novo tubo de microcentrífuga.

Observe que uma concentração de um vezes 10 à quinta até um vezes 10 à sétima células por mililitro é recomendada para o ensaio, embora a concentração não precise ser exata. Em seguida, adicione um microlitro do reagente Tally Dead Cell Red. Então, vortexe brevemente para homogeneizar, e incube a mistura de reagente de coloração e células à temperatura ambiente, no escuro, por um a cinco minutos.

Após a incubação, prossiga imediatamente para a análise no citômetro baseado em imagem tally. O tally utiliza lâminas descartáveis de plástico projetadas especificamente para o instrumento. Sempre certifique-se de segurar a lâmina pelas bordas ao carregá-la.

Pipete 25 microlitros da amostra lentamente em uma das áreas em forma de meia-lua para carregamento de amostras. Aqui, as células controle não transduzidas e não coradas são carregadas na câmara A e as células coradas que expressam GFP são carregadas na câmara B. Para realizar um ensaio de viabilidade em células que expressam GFP, toque em G-F-P-R-F-P na tela inicial do citômetro. As opções do ensaio aparecerão então à direita; selecione GFP mais viabilidade.

O instrumento perguntará então se a série de amostras deve ser nomeada para nomear a série de amostras. Pressione nomear agora. Em seguida, utilizando a tela de toque, digite o nome da série de amostras e pressione salvar; o citômetro de contagem avançará automaticamente para a tela de medição.

Em seguida, para medir a fluorescência de fundo, pressione a aba de fundo na metade inferior direita da tela de medição, conforme mostrado aqui. A configuração padrão indica que nove campos de células serão imageados. Agora, com a amostra controle voltada para longe do instrumento, insira a lâmina na porta de carregamento até que pare.

Não aplique força no toque da tela de fundo para inserir o controle novo de células não coradas. O lâmina será automaticamente puxada para dentro do instrumento e uma imagem em tempo real das células será exibida na tela. Usando o botão de foco, traga as células para o plano de visão adequado enquanto ajusta o foco.

Deslize o botão vermelho de zoom para quatro x ou 16 x. Para visualizar melhor a população celular, as células devem apresentar coloração uniformemente escura com um halo brilhante ao redor de cada uma. Conforme mostrado aqui, as células podem ser subestimadas quando a transição entre o fundo e as bordas das células é difusa, de modo que os limites celulares não fiquem bem definidos.

As células podem ser superestimadas quando possuem centros brilhantes e periferias escuras. Após colocar as células em foco, toque e pressione para executar o controle de células não coradas. Para medir a fluorescência de fundo, o citômetro capturará automaticamente imagens e exibirá miniaturas de cada campo de visão.

A barra de progresso fornece uma atualização contínua da análise. Após a captura da imagem ser concluída, o citômetro ejetará automaticamente a lâmina e fornecerá os dados da análise das imagens capturadas. Os dados armazenados são exibidos no menu suspenso da aba de fundo.

A amostra de controle de fundo receberá o mesmo nome atribuído ao experimento. Para executar a amostra transduzida com GFP corada com iodeto de propídio, remova a lâmina do instrumento, gire-a e reinsira-a com a amostra transduzida voltada para longe do instrumento. Pressione a aba da amostra e, em seguida, toque para inserir a nova amostra.

Quando a imagem aparecer na tela, use o botão de foco para colocar as células em foco. Como antes, toque para pressionar e executar a amostra. Após a conclusão da captura da imagem, os dados da análise aparecem na guia de amostra e o citômetro ejetará automaticamente a lâmina adequadamente.

Descarte o lâmina de análise celular de contagem. Como resíduo biológico perigoso, essas lâminas não podem ser reutilizadas. Após a execução da amostra, os limiares podem ser aplicados à amostra.

Para analisar populações celulares específicas aqui, ajustaremos os limiares para determinar a porcentagem de células vivas e mortas. Em células que expressam GFP, na guia amostra, são exibidos o número e a porcentagem de células que expressam GFP, células vivas que expressam GFP, células mortas que expressam GFP, viabilidade total, tamanho médio das células, número de células contadas e concentração celular.

Além disso, gráficos de histograma exibindo tamanho celular, fluorescência verde e fluorescência vermelha são mostrados na parte inferior da tela. Para definir o gate de tamanho celular, toque na miniatura de tamanho celular para abrir o histograma de tamanho celular e excluir qualquer debris. Mova as barras deslizantes azuis para excluir eventos grandes e pequenos.

Toque para aplicar e incluir as células dentro dos limites. Em seguida, para adicionar a fluorescência GFP à análise, toque na miniatura do histograma de GFP. Para abri-lo.

Mova a barra deslizante azul para ajustar o limiar logo à direita do pico mais fraco. Utilize a amostra controle como referência. Isso permite que a análise inclua as células positivas para GFP, mas exclua as células autofluorescentes.

A autofluorescência é frequentemente observada quando moléculas biológicas dentro das células são excitadas. Toque para confirmar e retorne à tela anterior. Os dados exibidos na guia amostra devem agora refletir as portas e limiares definidos para ambos os canais de fluorescência. Em seguida, para separar as células coradas com PI da autofluorescência ou de qualquer fundo presente na amostra, pressione a miniatura do histograma de PI para abri-lo novamente.

O pico da amostra controle será exibido como um pico cinza no histograma. O pico vermelho é a fluorescência da amostra. A fluorescência de fundo é exibida como o pico mais próximo do valor zero de RFU neste instrumento.

Para eliminar a fluorescência de fundo no canal de PI, mova a barra deslizante azul para ajustar o limiar. Para excluir este pico, utilize o pico cinza da amostra controle como referência. Quando o limiar no canal de PI estiver adequadamente definido, toque em aplicar para confirmar e retornar à tela anterior; o instrumento de contagem voltará a analisar automaticamente os dados e atualizará os resultados na guia da amostra.

Em seguida, para confirmar visualmente que cada célula foi corretamente atribuída, pressione a aba de zoom e selecione um campo de visão capturado para revisão pressionando a miniatura da imagem. Depois, pressione a aba camadas. Em seguida, pressione o botão GFP ou PI para exibir a imagem capturada por meio desse canal.

Pressione o mesmo botão novamente para remover a camada da exibição ou para sobrepor camadas; toque nos botões correspondentes a cada canal para identificar como as células são contadas por um canal específico. Toque nos círculos que envolvem as células contadas apenas pelo canal de campo claro, as quais não expressam fluorescência e serão circuladas em azul. Isso indica que uma célula específica está viva e expressando no canal verde.

O GFP será circundado em verde nas células que expressam no canal vermelho. As células coradas com PI serão circundadas em vermelho e são células mortas contadas em ambos. O canal vermelho e o verde serão circundados em amarelo.

Isso indica que a célula expressa GFP, mas também está corada com pi e, portanto, está morta. Ocasionalmente, um círculo preto aparecerá na tela. Esses são objetos que foram identificados, mas excluídos da análise com base no tamanho celular.

Continue a ajustar finamente o limiar no histograma de fluorescência usando os passos descritos até que cada célula que expressa fluorescência seja circulada com a cor apropriada. Todos os parâmetros de análise são automaticamente salvos no instrumento. Na guia de dados.

O aparelho pode armazenar arquivos de dados de 500 execuções de amostras. Cada arquivo armazenado na guia de dados está disponível para reanálise. Ao selecionar o arquivo na guia de dados, ele será reaberto e todos os histogramas e camadas ficarão ativos para arquivar dados e gerar relatórios.

Os dados armazenados no instrumento podem ser transferidos para um computador usando uma unidade USB. Quatro tipos representativos de células foram transduzidos com uma construção viral GFP direcionada ao núcleo, marcados com o kit de viabilidade Tally utilizando o reagente Dead Cell Red e analisados no Tally em um citômetro de fluxo, conforme mostrado aqui. Ambos os métodos relataram aproximadamente a mesma porcentagem da população para cada tipo celular que expressava GFP, juntamente com a porcentagem da população total que era viável e expressava GFP.

Esses dados demonstram que o citômetro Tali é capaz de discriminar entre a expressão total de GFP em uma população e a expressão de GFP na população de células vivas. Acabamos de demonstrar como utilizar o citômetro baseado em imagens Tali para avaliar a expressão de fluorescência e a viabilidade em sua amostra celular. Esta tecnologia preenche a lacuna entre estudos celulares individuais e populacionais.

Utilizando o citômetro baseado em imagem de contagem, é possível coletar informações visuais quantitativas e qualitativas sobre células individuais, bem como sobre populações celulares maiores. Utilizando o mesmo procedimento, diversos outros ensaios podem ser realizados, incluindo apoptose, expressão de RFP e viabilidade celular. Para células não expressoras, as aplicações potenciais incluem a avaliação da expressão gênica até estudos sobre a eficácia de fármacos.