Preparação de amostras de

O objetivo deste procedimento é analisar extratos livres de células de Mycobacterium tuberculosis por metabolômica de RMN, primeiramente cultivando e colhendo as células em um estágio apropriado de crescimento. Em seguida, lise as células e obtenha extratos livres de células para análise. Re-suspenda os extratos liofilizados em tampão para análise por RMN.

Por fim, colete os dados de RMN e analise os espectros com software para identificar os metabólitos. Em última análise, a análise por RMN de Mycobacterium tuberculosis é utilizada para demonstrar preservações nos níveis de metabólitos após diversos tratamentos. A metabolômica por RMN pode ser aplicada a aspectos fundamentais da fisiologia de Mycobacterium tuberculosis, como vias metabólicas importantes.

Esse entendimento é fundamental para elucidar os mecanismos de ação e resistência de fármacos e para identificar novos alvos para o desenvolvimento de medicamentos. Geralmente, indivíduos novos nesse método enfrentariam dificuldades devido à incapacidade de manipular todas as amostras exatamente da mesma forma, o que introduziria variações desnecessárias e resultados provenientes do meu laboratório. Steven Luka, doutorando, demonstrará os procedimentos para manipular as amostras para processamento por RMN. Do meu laboratório, a gerente do laboratório de pesquisa e Robert Fenton, técnico de pesquisa três, agora demonstrarão os procedimentos para manipular culturas de Mycobacterium tuberculosis ao conduzir M. tuberculosis.

A pesquisa seguiu as práticas de nível de biossegurança três conforme definido pelas diretrizes institucionais. Embora os rótulos neste vídeo indiquem microbacterium tuberculosis por considerações de biossegurança, esta demonstração utilizou o mycobacterium magmatic não patogênico. Comece descongelando um estoque de glicerol a 50% de M tuberculosis em gelo.

Inocule 0,15 mililitros em 110 mililitros de caldo M-A-D-C-T-W no frasco ER e meu frasco e cultive as culturas a 37 graus Celsius com agitação a 100 RPM por aproximadamente seis dias. Se não forem necessários antibióticos, adições alternativas ou outros tratamentos. Recolha as culturas para culturas que requerem tratamentos.

Reserve 0,5 mililitro de Eloqua em gelo para cultura, titulação e controle de qualidade. Em seguida, realize o tratamento desejado e recoloque as culturas no agitador após o período de tratamento. Retire um mililitro e determine a DO 600.

Além disso, reserve uma amostra de 0,5 mililitro para cultura, titulação e controle de qualidade. Mantenha as células em gelo durante todo o restante do protocolo. Recolha as células em quatro tubos de 50 mililitros por centrifugação após lavagem com 15 mililitros de água destilada duplamente gelada.

Resuspenda os pellets em alíquotas de 10 mililitros. Retire duas alíquotas e faça a centrifugação para obter o pellet, depois ressuspenda o pellet celular em um volume final de um mililitro de água bidestilada. Se desejar uma suspensão simples de células livre de agregados, passe as células através de uma agulha de 27 graus.

Três vezes, transfira a suspensão celular de um mililitro para um tubo de dois mililitros com tampa rosqueável contendo matriz de lisagem B. Posicione o homogeneizador de lise Fast Prep 24 dentro da cabine de segurança biológica. Coloque as amostras no porta-amostras, fixando a placa de travamento. Em seguida, processe durante 60 segundos em uma velocidade de seis metros por segundo.

Em seguida, centrifugue as amostras para formar um pellet de detritos celulares e células intactas. Então, passe o sobrenadante através de um filtro de seringa de 0,2 mícron para um tubo estéril para garantir a ausência de células viáveis. Plaque 0,1 mililitro da amostra em MADC.Agar.

Congele as amostras em um banho de gelo seco com etanol e armazene a menos 80 graus Celsius até que estejam prontas para serem liofilizadas e processadas em uma instalação de RMN. Após dois meses, verifique as placas para confirmar a ausência de unidades formadoras de colônia. Se nenhuma UFC for encontrada, as amostras podem ser removidas do laboratório BSL 3 para análises adicionais em uma instalação padrão de RMN.

Após secar as amostras até a completa desidratação, reconstitua-as em 0,7 mililitros de tampão para RMN e transfira para um tubo de microcentrífuga. Centrifugue por três minutos a 13.000 × g, remova 0,6 mililitros e transfira para um tubo de RMN de cinco milímetros. Na análise de meios, uma grade personalizada facilita o carregamento de múltiplos tubos de RMN nos spinners na profundidade correta.

Em seguida, transfira as amostras para o espectrômetro de RMN para inserção no trocador de amostras A-B-A-C-S com capacidade para 20 amostras. Alterne entre culturas não tratadas e tratadas com fármaco. A primeira amostra deve ser pré-carregada no ímã no início de uma sequência automatizada.

Para calibrar o instrumento, otimize a duração do pulso de 90 graus com uma única amostra e ajuste o instrumento para as amostras restantes. Utilize o ícone NMR e grad shim. Automatize o travamento, o shim e a coleta de dados de RMN para cada amostra.

Para um espectro de RMN de hidrogênio 1D, selecione a sequência de pulsos com supressão de água e esculpimento de excitação. Defina um total de 32.000 pontos de dados, 128 varreduras e 16 varreduras fantasmas para um espectro QC de dois DH um C 13 hs. Selecione a sequência de pulsos.

Selecione um total de 2048 pontos de dados com largura de varredura ao longo da dimensão direta H unidimensional e 64 pontos de dados com largura de varredura ao longo da dimensão indireta C 13. Especifique também a coleta do espectro com 128 varreduras e 16 varreduras fantasmas para obter um bom sinal em relação ao ruído. Um espectro de m tuberculosis gerou aproximadamente 400 picos, incluindo 50 metabólitos conhecidos.

Por exemplo, o processamento de dados descrito no manuscrito suplementar gerou este espectro de metabólitos diretamente ou indiretamente associados à via da D-alanina. A magnitude das intensidades dos picos é proporcional às concentrações dos metabólitos presentes no extrato celular, de modo que perturbações relativas em metabólitos e vias metabólicas podem ser quantificadas entre amostras e tratamentos. A metabolômica LMR abre caminho para pesquisas na área de bacteriologia explorarem a fisiologia e a patogênese em visual e micobactérias, outros micro-organismos patogênicos ou não patogênicos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar múltiplos extratos celulares de tuberculose para metabolômica por RMN, e principalmente manter a consistência em todo o protocolo para obter resultados confiáveis.