Determinando a atividade citotóxica Optimal específicos de células CD8 Her2neu Humanos T, comparando a Cr51 Ensaio de Libertação do Sistema xCELLigence

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar a atividade de linfócitos T citotóxicos comparando uma abordagem baseada em impedância, utilizando o sistema EXOGEN, com o ensaio de liberação de cromo. O primeiro passo é realizado separando-se as células mononucleares do sangue periférico do sangue total usando fial. Em seguida, os PBMC são adicionados a poços juntamente com antígeno peptídico, IL-2 recombinante humana e PBMC irradiados para gerar linfócitos T CD8 específicos para o antígeno.

Os linfócitos T CD8 específicos para o antígeno são então cultivados em co-cultura com células tumorais em ambos os ensaios, a fim de induzir a morte celular tumoral. São obtidos resultados que mostram a porcentagem de lise das células tumorais utilizando tanto o método de impedância quanto o ensaio de liberação de cromo. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o ensaio de liberação de cromo, é que o sistema baseado em impedância coleta dados em tempo real e exige menos células, as quais não precisam ser marcadas. Para este protocolo, sangue de doadores saudáveis normais positivos para HLA-A2 fornece uma fonte de PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) seguindo o protocolo do fabricante.

Utilize F call PA mais para separar as P BMCs do sangue. Em seguida, distribua aproximadamente 4 milhões de P BMCs em placas de seis poços, com dois mililitros de meio por poço. A cada poço, adicione o peptídeo ligante HLAA dois para uma concentração final de 10 microgramas por mililitro de cultura.

As células em dias alternados para ajudar a estimular e expandir os linfócitos T. Adicione meio fresco suplementado com IL recombinante humana dois para uma concentração final de 50 unidades por mililitro. Após uma semana, prepare uma cultura de pbmc autólogos, irradie as células e as pulse por duas horas com o mesmo hla.

Uma dupla ligação peptídica a 10 microgramas por mililitro restimula a cultura, adicionando um mililitro das PBMC autólogas irradiadas a cada uma. Continue adicionando meio fresco suplementado com IL-2 em dias alternados; após outra semana, restimule as culturas da mesma maneira pela segunda vez. Após mais seis dias em cultura, as células estarão prontas para uso.

Prepare a estação de medição de impedância celular para uso, equilibrando-a a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono por pelo menos uma hora. Colete células tumorais humanas com 75% de confluência utilizando tripsina a 0,25% e centrifugação. Conte as células tumorais usando um hemocitômetro e reconstitua-as em RPMI.

Meio tumoral numa concentração de 7.500 células por microlitro. Em seguida, o programa do software agente Excel configurou a página de layout com o arranjo dos poços. Configure a página de programação para realizar leituras de impedância a cada cinco minutos durante um período de 40 horas; nas primeiras 18 horas, o sistema Xceligent realizará apenas leituras de impedância das células tumorais.

Em seguida, adicione 100 microlitros de meio tumoral RPMI por poço. Obtenha uma leitura de fundo nos EPLs medindo a impedância na ausência de células. Após a adição das células tumorais, carregue as placas na estação e inicie as leituras.

As células tumorais começarão imediatamente a aderir aos EPLs. Após cerca de 18 horas de incubação, as células tumorais terão se ligado aos EPLs e se duplicado para 15.000 células tumorais por poço. Neste momento, recolha as células T preparadas por meio de raspagem suave e centrifugação com agitação.

Os linfócitos T, reconstituí-los em meio RPMI com 10% de FBS e contá-los utilizando um hemocitômetro. Uma vez conhecida a densidade celular, prepare uma série de diluições em duplicação tal que, quando 200 microlitros de linfócitos T forem adicionados às células tumorais, a concentração mais alta seja de 40 linfócitos T por célula tumoral. A última diluição da série deve fornecer 1,25 linfócito T por célula tumoral.

Pare a estação EXOGEN e remova o EPL usando uma pipeta. Remova o meio dos poços, então adicione 200 microlitros de células T usando todas as concentrações da série de diluição como controle negativo. Utilize meio puro, retorne o EPL à estação e continue o programa ao final do ensaio.

Normalize os resultados. Siga sempre os procedimentos institucionais de segurança radiológica ao trabalhar com cromo 51 e células-alvo marcadas com cromo 51, e utilize blindagem para reduzir a exposição à radiação. Comece pulsando células tumorais por duas horas a 1 milhão de células por mililitro com 10 microlitros por mililitro de cromo 51 fresco.

Em seguida, lave as células tumorais em 10 mililitros de meio RPMI com 10% de FBS, centrifugue as células e reconstitua-as no mesmo meio a 1 milhão de células por mililitro. Depois, em uma placa de 96 poços com fundo redondo, adicione 100.000 células tumorais por poço para calcular a liberação espontânea.

Não adicione nada a seis dessas placas em seis outras placas. Adicione 100 microlitros de Triton X-100 para lisar as células e, assim, calcular a liberação máxima em todas as placas restantes. Adicione linfócitos T à placa utilizando a série de diluições preparada anteriormente.

Agora, incube as placas por cinco horas e colete amostras de 50 microlitros de sobrenadante de cada poço. Carregue as amostras em uma placa luma após secar as placas na câmara de fluxo laminar durante a noite à temperatura ambiente. Meça os CPM utilizando um contador gama T-cell e SKBR três. As células cancerígenas foram cultivadas em placas X intelligence e o índice de células foi medido, o que reflete a impedância da placa, já que as células T não precisam aderir para proliferar.

Seu efeito sobre a impedância foi desprezível durante um cultivo de 40 horas. Células cancerígenas cultivadas isoladamente mostraram uma medida crescente de impedância. No entanto, a adição de linfócitos T após 18 horas interrompe essa tendência.

Esse evento requer normalização por software após a adição de células T e é investigado mais detalhadamente no próximo experimento. Quando células SK BR três foram cultivadas em co-cultura com concentrações variáveis de células T, as reduções na impedância foram muito claramente dependentes da dose de células T; os dados foram coletados a cada cinco minutos durante três ensaios no momento de 10 horas. Os índices celulares seguiram um polinômio de segunda ordem ao longo da faixa de concentrações de células T, indicando que a estação Exogen monitora em tempo real a morte mediada por células T CD8+ em tumores SK B três por meio de uma queda no índice celular, a fim de determinar se as reduções na impedância de células SK BR três pelas células T são específicas para antígeno.

Três células SK KBR foram cultivadas em co-cultura com linfócitos T específicos para FLU, positivos para HLA A2, que não reconhecem a nova HER2. Essas células apresentaram atividade lítica significativamente menor. Para determinar mais se os linfócitos T específicos para a nova HER2 estavam induzindo morte de forma específica ao antígeno, um anticorpo contra a ligação rápida foi incorporado nas co-culturas. O anticorpo não reduziu a atividade lítica dos linfócitos T específicos para a nova HER2 P360-9.

No entanto, com linfócitos T ativados de forma não específica por microesferas anti-CD3, CD28, o anticorpo inibiu a lise, o que determinou se a morte ocorria de maneira dependente da classe I do HLA. Anticorpos anti-classe I do HLA ou anticorpos de controle isotípico foram adicionados às culturas em co-cultivo. Os resultados apoiaram fortemente essa hipótese.

Os linfócitos T foram posteriormente cocultivados com outras células cancerígenas em uma proporção de um para cinco. A linhagem celular tumoral negativa para HLA A dois, BT 20, foi utilizada como controle negativo. Os resultados demonstram que o método é útil para múltiplas células tumorais aderentes-alvo.

Coculturas das novas linhagens de células T específicas para HER2 P360-9 foram adicionadas a células-alvo marcadas com cromo-51, seguidas por análise de CRA. O ensaio de citotoxicidade parece mais sensível para analisar a consistência. A variação intrassenso foi calculada como o coeficiente percentual de variação em cada proporção celular entre 1:40 e 1:5.

Isso foi medido abaixo de 15% nas menores proporções celulares. No entanto, o coeficiente de variação percentual foi alto ou imprevisível. Além disso, examinou-se a variabilidade da lise de células T SK BR três por cocultivo com diferentes linhagens de células T específicas para P 360 9.

Os dados foram gerados com intervalo de 30 dias. Os ensaios foram realizados em triplicata e os resultados foram muito semelhantes. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar a atividade de células T citotóxicas utilizando células T CD8 específicas para antígeno e células tumorais, com uma abordagem baseada em impedância.