Técnicas Analíticas para ensaiar Bioatividade Óxido Nítrico

O objetivo geral do seguinte experimento é demonstrar como detectar com precisão e especificidade os metabólitos do óxido nítrico em amostras biológicas. Isso é alcançado processando primeiro as amostras de sangue imediatamente após a coleta, para evitar a perda de metabólitos ou a formação de artefatos. Concomitantemente, realiza-se uma coleta rápida e eficiente de tecidos para minimizar os efeitos de um ambiente hipóxico sobre os metabólitos do óxido nítrico.

Anéis aórticos são coletados e suspensos em um banho de órgãos para avaliar sua função endotelial. Além disso, ensaios bioquímicos são utilizados para quantificar os níveis de nitrato, níveis de nitrito e os níveis relativos de nitro tióis e outros produtos nitrosados no tecido. Com o uso desses ensaios, uma comparação adequada entre animais experimentais e controles pode gerar informações valiosas sobre a produção e o metabolismo do óxido nítrico.

A principal vantagem do uso dessa abordagem multissistêmica em comparação com métodos ou ensaios únicos é que ela permite uma visão mais ampla da bioquímica do óxido nítrico em múltiplos sistemas orgânicos. Assim, podemos começar a entender quais desses metabólitos podem ter utilidade prognóstica ou diagnóstica e como o repertório de metabólitos do óxido nítrico reflete a formação e a disponibilidade de óxido nítrico endotelial. A demonstração visual deste método é fundamental, pois cada etapa do processo é crucial para manter a integridade da amostra.

Algumas dessas etapas não são evidentes pela leitura da seção de métodos em artigos típicos, devido ao detalhamento fino da coleta de amostras e extração de tecidos. Este procedimento será demonstrado pela Dra. Hong Jing, cientista sênior de pesquisa no meu laboratório. Para este protocolo, é necessário ter disponível uma pessoa ou animal experimental para coleta de sangue, sendo que os tecidos de animais experimentais também serão examinados.

Primeiro, colete sangue total inserindo uma agulha de 25 gauge na veia cava inferior. Após coletar de 500 a 1000 microlitros, perfunda o animal para remover o sangue remanescente infundindo tampão fisiológico através do ápice do ventrículo esquerdo e permita a substituição completa do sangue conforme o sangue e o tampão saem pela veia cava inferior. O sangue venoso deve ser coletado imediatamente após a coleta em tubos de centrífuga de 1,5 mililitros contendo NEM e EDTA.

Centrifugue o sangue a 14.300 RCF durante sete minutos após a centrifugação. Aspire o plasma do pellet de hemácias com uma pipeta e transfira-o para um tubo separado. Prepare as amostras de plasma isolado para HPLC adicionando primeiramente um volume igual de metanol frio a 50 microlitros da coleta de plasma.

Vortex, misture vigorosamente por três a cinco segundos até ficar turva. Em seguida, centrifugue a mistura a 14.300 RCF por sete minutos. Para precipitar as proteínas plasmáticas, colete o sobrenadante em um tubo separado de 1,5 mililitro e armazene a quatro graus Celsius até que possa ser analisado.

Para preparar o plasma para análise de quimioluminescência, pegue o volume restante de plasma, que deve ser de aproximadamente 200 a 400 microlitros, e divida-o em dois volumes. Prepare a metade do plasma adicionando um volume de 10% de sulfeto acidificado a 5% e aguarde 10 minutos. Esta amostra está agora pronta para análise por CLD.

Prepare a outra metade do plasma adicionando 10% do volume de cloreto de mercúrio a 2% após cinco minutos. À temperatura ambiente, adicione 10% do volume de sulfonamida acidificada. Aguarde mais 10 minutos e injete esta amostra no CLD da mesma forma que o plasma.

O pellet de hemácias pode ser preparado para HPLC e CLD para qualquer uma das análises. Comece misturando uma parte de pellet celular com quatro partes de solução hipotônica de lise. Agite a mistura completamente em vórtex para análise por CLD.

O preparo das células é o mesmo realizado para o plasma. Comece adicionando um volume igual de metanol. Em seguida, agite a mistura vigorosamente em vórtex por três a cinco segundos, seguido de centrifugação por sete minutos a 14.300 RCF.

Agora, aspire o sobrenatante e armazene-o a quatro graus Celsius até que possa ser analisado por CLAE para determinar os níveis teciduais de metabólitos do óxido nítrico. Em tecidos de interesse provenientes de animais experimentais, o sangue deve primeiro ser coletado e preparado conforme descrito na seção anterior; a coleta dos tecidos deve ser realizada de maneira habitual, com atenção especial à velocidade e eficiência, para que os tecidos não se tornem hipóxicos. Após a coleta, homogeneíze as amostras de tecido em uma proporção de um para cinco de PBS contendo N-E-M-E-D-T-A.

Em seguida, prepare os tecidos homogeneizados para análise por CLAE e CLD conforme descrito nas seções anteriores para hemácias. Após anestesiar um camundongo adulto com éter etílico e confirmar que ele não responde a um aperto no dedo do pé, realize uma toracotomia. Uma incisão mediana é feita do esterno até a região púbica para expor as cavidades torácica e abdominal.

A seguir, realize a perfusão do animal com tampão Krebs Alite oxigenado. Use uma seringa de 25 gauge para injetar o tampão no ápice do ventrículo esquerdo. O átrio direito deve ser cortado para fornecer uma saída para o sangue.

Após a perfusão, isole a aorta abdominal cortando e removendo o fígado, os pulmões e outros tecidos que possam cobrir a aorta. Em seguida, segure o coração com uma pinça e corte cuidadosamente a aorta da parede posterior do animal. Coloque o coração e a aorta em uma placa de Petri cheia de gelo.

Tamponete Krebs frio no recipiente. Corte e remova cuidadosamente a gordura e a adventícia da aorta. Evite danificar o endotélio interno do vaso durante a limpeza.

Mantenha o metabolismo das aortas lento para prevenir hipóxia, transferindo-as para tampão oxigenado gelado fresco a cada cinco minutos. Agora, use um bisturi para cortar a aorta em segmentos anulares com três milímetros de comprimento. Transfira os segmentos para um banho de tecidos orgânicos de quatro canais com 10 mililitros, contendo tampão de Krebs oxigenado.

Usando o botão do transdutor, aplique uma pré-tensão de 1,5 gramas a cada anel aórtico. De acordo com achados empíricos, 1,5 gramas é a tensão inicial apropriada para função vasomotora ideal.

No monitor de camundongo, monitore e registre a medição da força utilizando uma ponte octal de oito canais e software de aquisição de dados, permita que os anéis equilibrem por 80 minutos, trocando o tampão a cada 20 minutos, e então prossiga com o experimento. Após a tensão do tecido ter equilibrado, adicione 100 nanomolar de fenilefrina a cada anel para obter uma contração submáxima. Uma vez que a tensão do anel tenha se estabilizado e haja um nível constante de tônus, realize uma análise de resposta à dose de um agonista endotelial, como a acetilcolina.

Isso determinará a produção de óxido nítrico e o grau de relaxamento dos vasos. Após a resposta à dose de acetilcolina, lave os banhos com tampão de Krebs e adicione 100 nanomolar de fennel rine a cada banho de órgãos para contrair os vasos. Em seguida, determine novamente a resposta dos anéis de músculo liso a uma fonte exógena de óxido nítrico, como o nitroprussiato de sódio, na presença e ausência de ODQ, um inibidor da guanilato ciclase solúvel.

Esse tipo de abordagem determinará um valor de relaxamento de 100% para os vasos e também demonstra a natureza essencial da guanilato ciclase solúvel na mediação da resposta do óxido nítrico ao relaxamento vascular. Como o ODQ impedirá o relaxamento induzido pelo nitroprussiato de sódio em resposta à acetilcolina, anéis aórticos de camundongos controle saudáveis relaxaram, enquanto anéis aórticos de camundongos com disfunção endotelial apresentaram relaxamento reduzido devido à diminuição na produção de óxido nítrico. Ensaios específicos de desnitração também foram realizados nos animais controle, com detecção da quimioluminescência do nitrito.

RSNO e RNNO foram detectados utilizando um ensaio redutivo de desnitrosação. Ao subtrair as áreas dos picos, os níveis de nitrito e RSNO foram medidos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia do óxido nítrico e vascular, como, por exemplo, como os níveis circulantes desses metabólitos do óxido nítrico refletem os níveis teciduais e como os metabólitos da doença variam em diferentes condições patológicas?

A determinação das concentrações em estado estacionário e da meia-vida desses metabólitos relevantes de óxido nítrico em múltiplos sistemas orgânicos e ao longo da circulação de um único animal permitirá a identificação de assinaturas moleculares específicas de processos patológicos e nos ajudará a definir novas modalidades terapêuticas baseadas em óxido nítrico, o que permitirá ao clínico dispor de biomarcadores melhores para a gravidade ou progressão da doença. Em geral, indivíduos novos na área do ácido nítrico terão dificuldades porque muitos métodos não são sensíveis o suficiente para detectar e quantificar esses baixos níveis de metabólitos de ácido tric encontrado em amostras biológicas. Em primeiro lugar, uma técnica inadequada durante o processamento da amostra provavelmente criará artefatos que levarão a dados errôneos e à interpretação incorreta dos dados.