Métodos de Ensaio para Drosophila Comportamento

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar métodos para examinar comportamentos sensoriais, motores e de coordenação em drosófila. Isso é realizado primeiramente avaliando a função motora de larvas, utilizando o ensaio de rastejamento, avaliando a função motora de adultos, utilizando o ensaio do anel, e avaliando as habilidades de coordenação e sensoriais de adultos com o ensaio de cortejo. Em última instância, este conjunto de ensaios comportamentais pode mostrar como fatores genéticos e externos, como tratamentos com drogas, podem influenciar a atividade e a coordenação.

Intra sofala. A principal vantagem deste ensaio em relação a métodos existentes, como o eixo geo negativo, é que o ensaio em anel apresenta maior produtividade e sensibilidade. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área das doenças neurodegenerativas, como a detecção em estágios iniciais de defeitos locomotores.

Este ensaio será demonstrado pela Dra. Jamie Becknell, pós-doutoranda do meu laboratório. O ensaio de rastejamento larval é utilizado para medir o efeito de fatores genéticos e ambientais sobre a motilidade. Para começar, monte um cruzamento de 10 a 15 machos e 10 a 15 fêmeas virgens em um frasco padrão. Após 24 horas, os adultos saudáveis terão depositado ovos suficientes para povoar o frasco, mantendo essa população com idade correspondente a 24 horas.

Transfira os adultos para um frasco novo e repita o processo. Incube o frasco até que larvas de terceiro estágio sejam observadas no meio do frasco. Adicione 50 a 100 mililitros de sacarose 20% e deixe repousar por 20 minutos.

As larvas flutuarão até a superfície; colete-as utilizando uma pipeta serológica de 25 mililitros com a ponta cortada e coloque-as em um cesto de malha. Lave as larvas no cesto de malha duas vezes com água desionizada. Elas agora podem ser utilizadas em experimentos.

Para tratar as larvas com uma droga, use uma escova para transportar o número desejado de larvas para um béquer de cinco mililitros contendo uma solução de sacarose a 5% e a droga de interesse. Deixe-as se alimentarem da solução açucarada com droga por 15 minutos, depois despeje-as novamente através do cesto com malha, lave-as e prossiga com a medição do efeito da droga sobre a motilidade. Use uma escova para transportar uma larva individual para uma placa de Petri de 15 centímetros contendo ágar a 2%.

Coloque sobre uma folha de papel vegetal. Agora, colete os dados. Simplesmente conte o número de linhas da grade que a lava atravessa em um minuto.

Em seguida, utilize o pincel para transferir a larva para o poço de uma placa de dissecação de vidro contendo uma solução diluída de pasta de levedura, sob um microscópio estereoscópico, durante um período de um minuto, contando as contrações dos Percys. Uma única contração é contabilizada como um movimento completo do posterior para o anterior. Repita até que o número desejado de larvas tenha sido contado.

O protocolo do anel mede a velocidade locomotora de animais adultos. Colete moscas machos adultas recém-emergidas sob anestesia leve e transfira-as para um frasco padrão contendo alimento normal ou com drogas. Coloque aproximadamente 25 moscas por frasco. Mantenha as moscas à temperatura ambiente por dois a três dias para uma recuperação completa da anestesia e acúmulo de níveis estáveis da droga.

Em seguida, transfira cerca de 25 moscas sem anestesia para frascos de poliestireno com tampas moldadas e monte os frascos em um ou mais aparelhos em forma de anel. Deixe as moscas descansarem por 15 a 20 minutos enquanto alinha uma câmera digital para fotografar os frascos em vista lateral, tenha um cronômetro preparado e configure-o para a duração desejada do ensaio. Normalmente, três segundos para realizar o ensaio.

Segure o aparelho em forma de anel com uma das mãos sem perturbar as moscas e, com a outra mão, segure firmamente o temporizador da câmera. Bata com o aparelho na bancada três vezes para derrubar as moscas e, simultaneamente, inicie a contagem regressiva da câmera. Repita o ensaio uma vez por minuto até que cinco ou seis tentativas tenham sido realizadas.

É fundamental não reutilizar os frascos de teste de poliestireno após a coleta dos conjuntos iniciais de dados. Porque moscas novas colocadas em frascos usados não subirão na mesma extensão que moscas colocadas em frascos novos. Para coletar os dados, utilize um visualizador de imagens para pontuar a altura média, subida pelos diferentes grupos.

Este ensaio requer cruzamentos genéticos preparados em frascos que estejam produzindo prole abundante para coletar moscas para o ensaio. Dentro de algumas horas do amanhecer subjetivo do animal, esvazie os frascos para coletar todos os adultos em intervalos de três a quatro horas. Colete machos e fêmeas recém-emergidos e sexualmente ingênuos, mantenha os machos individualmente em frascos ou tubos com alimento e as fêmeas em grupos de cinco a seis.

Em recintos semelhantes, são necessários números iguais de machos e fêmeas para o ensaio. Após isolar as moscas coletadas por cinco dias, prepare-se para carregá-las em uma roda de acasalamento e realizar o ensaio. Em seguida, transfira cuidadosamente uma fêmea e um macho para a câmara de uma roda de acasalamento sob um microscópio estereoscópico.

Observe o par por 10 minutos ou até que acasalem com sucesso durante esse período. Registre quando cada um de vários comportamentos é observado pela primeira vez. Registre quando o macho se vira pela primeira vez em direção à fêmea.

Quando o macho toca pela primeira vez a fêmea com sua pata, registre o momento em que o macho estende e vibra uma asa; registre quando o macho lambe pela primeira vez as genitálias da fêmea; registre quando o macho enrola pela primeira vez o abdômen sob si mesmo. Registre o momento em que o macho tenta montar pela primeira vez a fêmea. Por fim, registre o tempo total dedicado ao comportamento de cortejo até que a cópula ocorra.

Para animais do tipo selvagem, isso ocorre quase sempre dentro de cinco a dez minutos; colete os dados por meio de três parâmetros diferentes. Primeiro, a latência de um comportamento é o tempo necessário até que ele seja observado pela primeira vez. Segundo, a frequência de um comportamento indica se ele é ou não observado.

E terceiro, o índice de corte é o tempo gasto em corte dividido pelo tempo total até a cópula em um experimento com animais. Portadores de mutações em F-U-S-T-L-S relacionadas à esclerose lateral amiotrófica. Mutantes do gene com inserção central apresentaram metade da capacidade de rastejamento dos controles do tipo selvagem à esquerda e uma mutação de sentido trocado R 5 21 C reduziu a velocidade de rastejamento para apenas cerca de um centímetro por minuto.

O teste de anel em moscas adultas jovens do tipo selvagem resultou em uma altura média escalada entre três e cinco centímetros durante um período de três segundos. Neste ensaio, nenhuma dessensibilização foi observada durante até cinco ensaios consecutivos espaçados por um minuto enquanto se realizava o teste de anel. É importante lembrar de ser o mais preciso possível em relação ao tempo.

Uma vez dominado, o ensaio de superlotação larval pode ser realizado em 30 a 40 minutos para observar 10 ensaios de um genótipo, se for executado corretamente. Após assistir a este vídeo, você também deverá ter uma boa compreensão de como observar e pontuar os comportamentos de corte no inseto.