Cultura e Aplicações de rotação parede biorreator navio Derivado 3D Modelos de células epiteliais

Este protocolo não convencional apresenta um sistema simples e robusto para cultivar células epiteliais humanas em modelos tridimensionais organotípicos que recapitulam o tecido humano in vivo. Primeiro, as células epiteliais são cultivadas até formarem uma monocamada confluente em um frasco de cultura de tecidos, colhidas e então combinadas com microesferas em um biorreator STLV. O STLV é girado na plataforma para criar um ambiente de queda livre constante com baixa tensão de cisalhamento do fluido, permitindo que as células adiram e cresçam nas esferas e formem agregados celulares após 96 horas e aproximadamente a cada dia subsequente.

Reponha o meio no SDLV para acomodar o metabolismo celular após a formação de agregados; realize imagens das amostras por microscopia óptica semanalmente para monitorar a progressão do desenvolvimento, uma vez que a formação completa dos agregados e a diferenciação celular tenham ocorrido. Plante os agregados para análises experimentais e ensaios posteriores. Em última instância, este sistema pode gerar modelos organotípicos semelhantes aos in vivo para uma infinidade de investigações científicas.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o cultivo celular convencional, é que as células epiteliais se diferenciarão e polarizarão em agregados semelhantes a tecidos, comportando-se, assim, morfológica e funcionalmente de maneira semelhante ao tecido humano autêntico. Este sistema de modelo 3D fornece uma compreensão mais profunda da biologia das células epiteliais, das interações entre hospedeiro e patógeno e da complexa interação entre os tipos celulares que podem ser introduzidos no sistema. Dr. Andrea Radkey.

Um pós-doutorando do meu laboratório irá agora demonstrar este procedimento para desintoxicar o biorreator lateral de rotação lenta. Tampe as portas abertas com tampas de segurança. Encha o STLV com etanol a 95% e equilibre por 24 horas.

Remova o etanol, depois preencha com água destilada esterilizada e incube por 24 horas utilizando os instrumentos fornecidos pelo fabricante, solte todos os parafusos e remova o tampão central do STLV. Coloque-os em uma embalagem para esterilização e autoclave a 110 graus Celsius por 20 minutos. Remonte o STLV e repita a desintoxicação para garantir a esterilidade.

A seguir, aperte os parafusos do STLV. Conecte a válvula de retenção pré-esterilizada a cada porta. Agora, remova os êmbolos de uma seringa de bloqueio de encaixe de 10 mililitros e de uma seringa de cinco mililitros, mantendo os êmbolos nas embalagens.

Para manter a esterilidade, rosqueie as seringas na torneira de fechamento. Prossiga adicionando DPBS à seringa de 10 mililitros até que o STLV esteja cheio e a seringa de cinco mililitros comece a se encher. Em seguida, recoloque os êmbolos estéreis em cada seringa e remova quaisquer bolhas residuais no biorreator alternando entre o acionamento dos êmbolos das seringas.

Feche as torneiras de fechamento e conecte o STLV à plataforma vertical rotativa. Gire durante um mínimo de 24 horas para monitorar vazamentos em um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione 15 mililitros de DPBS a 250 miligramas de microesferas de CytoDex e autoclave após o resfriamento.

Remova o DPBS lavando três vezes com meio de cultura para as células epiteliais. Agite o tubo para ressuspender as microesferas. Em seguida, ressuspender as microesferas em 15 mililitros de meio de cultura.

Primeiro, cultive um vezes 10 à sétima, células epiteliais como monocamadas em frascos de cultura de tecidos. Recolha as células e realize a contagem e determinação da viabilidade celular por exclusão de azul de trian. Coloração, adicione as células às esferas preparadas.

Lave o tubo cônico para garantir a transferência de todas as células. Em seguida, remova o DPBS e as seringas do STLV. Além disso, remova a tampa do orifício central utilizando uma pipeta serológica de 10 mililitros.

Carregue a suspensão de células epiteliais com esferas no STLV. Enxágue o tubo cônico uma vez para transferir todas as células e esferas. Em seguida, substitua a tampa do orifício central.

Em seguida, remova os êmbolos de uma seringa de cinco mililitros e de uma seringa de 10 mililitros e recoloque os êmbolos nas embalagens. Para manter a esterilidade, parafuse as bocas em polegadas das seringas com torneiras abertas. Encha o STLV com meio de cultura.

Substitua as hastes e feche a torneira de três vias. Agora, equilibre a cultura recém-semeada de STLV em uma incubadora a 37 graus Celsius por 30 minutos sem rotação. Após remover o STLV da incubadora, abra a torneira de três vias.

Remova todas as bolhas utilizando os êmbolos e feche a torneira de fechamento. Em seguida, configure o STLV para rotação contínua a 20 RPM na incubadora. Após 96 a 120 horas, troque o meio removendo as seringas e abrindo ambas as torneiras, inclinando o STLV para permitir que as esferas e as células sedimentem.

Uma vez assentado, retire cerca de 75% do meio do porto lateral utilizando as seringas para realizar o protocolo de alimentação. Novamente, continue a repor o meio conforme necessário, com base no metabolismo celular. Também monitore o crescimento e a viabilidade dos agregados a cada cinco a sete dias.

Para evitar a cisalhamento de agregados, utilize uma ponteira de pipeta de 1000 microlitros que tenha sido cortada cerca de dois centímetros a partir da ponta e esterilizada. Remova cuidadosamente 200 microlitros de agregados do orifício central e distribua em duas tubos de 1,5 mililitro. Utilize uma alíquota para monitorar a viabilidade celular. Após a liberação das células das microesferas, avalie a viabilidade pelo método de exclusão de azul de trian.

Coloração para a obtenção de imagens de agregados celulares. Adicione 0,5 a um mililitro de meio ao segundo alíquota de 1,5 mililitro de agregados e transfira para uma pequena placa de Petri utilizando uma ponteira de pipeta de 1000 microlitros cortada. Obtenha imagens dos agregados.

Usando um microscópio invertido de luz para alguns modelos de células epiteliais, é necessário transferir os agregados para um recipiente descartável pela metade para aumentar a aeração do cultivo aproximadamente uma semana antes da coleta dos agregados. Para análise, remova as seringas do STLV e descarte cerca de 50% do meio pelo orifício lateral. Remova o tampão central e despeje cuidadosamente todo o conteúdo em um tubo cônico de 50 mililitros pelo orifício central.

Lave o STLV duas vezes com cinco mililitros de meio e combine as lavagens com os agregados colhidos. Em seguida, transfira os agregados do tubo cônico de 50 mililitros para o Harv. Após uma semana, colete cuidadosamente os agregados para potenciais formatos de ensaio; ensaios e análises demonstraram que agregados epiteliais humanos diferenciados foram cultivados no sistema de biorreator STLV.

As imagens de MEV e MET são obtidas de células vaginais humanas cultivadas no STLV por 39 dias. Observe que os agregados tridimensionais exibem características ultraestruturais semelhantes às de tecidos, como micros saliências, invaginações, vesículas secretoras intracelulares e microvilosidades na superfície apical. Imagens de microscopia de imunofluorescência confocal de células vaginais tridimensionais indicam expressão de mucina e marcadores específicos para células epiteliais e diferenciação terminal. Fenótipos fisiologicamente relevantes também servem como uma excelente plataforma para avaliar a toxicidade de compostos.

O ensaio MTT, um teste comumente utilizado para medir viabilidade celular, metabolismo ou proliferação, pode ser empregado para avaliar a toxicidade de diversos produtos químicos e compostos. Alternativamente, meça a toxicidade após o tratamento com compostos em teste pelo método de exclusão de azul de tripano. Neste exemplo, após o tratamento com NONOXINOL nove, os agregados vaginais demonstraram uma resposta de toxicidade semelhante à observada em modelos explicantes cervicais X, mas um perfil distinto em comparação com monocamadas.

Os agregados tridimensionais são funcionalmente responsivos, por exemplo, após estimulação com moléculas derivadas de micróbios que são reconhecidas pelos receptores tipo toll. Os agregados respondem e secretam citocinas pró-inflamatórias, incluindo a proteína IL-6 e a expressão do transcripto do receptor de progesterona. Um receptor que responde à estimulação hormonal também pode ser observado nas células vaginais.

Os agregados tridimensionais não apenas têm a capacidade de responder a moléculas de patógenos e hormônios, mas também são capazes de suportar funcionalmente uma infecção pelo vírus do herpes simples tipo dois. Uma imagem de microscopia confocal de agregados vaginais tridimensionais infectados pelo HSV-2 demonstra a infecção. As propriedades físicas e funcionais de células individuais dentro dos agregados também podem ser quantificadas por citometria de fluxo, por exemplo, por meio de ensaio de citometria de fluxo para medir a expressão superficial de mucina um em células vaginais individuais.

Os agregados tridimensionais vaginais expressaram uma porcentagem menor de muck um em sua superfície em comparação com monocamadas após seu desenvolvimento. Esta técnica permitiu que pesquisadores nas áreas de biologia tecidual e doenças infecciosas estudassem a estrutura e as respostas fisiológicas a estímulos. Utilizando esses modelos organotípicos, melhor simulamos a biologia humana.