O Uso de cistometria em pequenos roedores: Um Estudo de Chemosensation Bexiga

O objetivo deste procedimento é determinar a influência de compostos químicos sobre as funções de armazenamento e esvaziamento da bexiga. Isso é realizado primeiramente implantando-se um cateter na bexiga. Após um breve período de recuperação, uma solução controle é infundida pelo cateter durante 30 minutos.

À medida que a pressão intravesical e o volume urinário são registrados ao longo de mais 30 minutos, o animal recebe infusão de um composto de interesse. Em última análise, os resultados podem demonstrar como substâncias irritantes também afetam o padrão de micção por meio da análise da frequência miccional. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o registro da contratilidade da bexiga isolada, é que a função deste órgão pode ser estudada em condições mais fisiológicas.

Por exemplo, as ações regulatórias do sistema nervoso central são preservadas. A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos cirúrgicos são difíceis de aprender, já que há uma série de detalhes técnicos e manobras que devem ser observados para garantir o sucesso do experimento. Para preparar o tubo que você deseja implantar na bexiga primeiro, corte um tubo PE 50 no comprimento desejado e coloque um pequeno pedaço branco de cateter de 18 gauge sobre o cateter principal.

Em seguida, crie uma pequena alça na extremidade aquecendo uma das pontas do tubo com chama e lave-a com solução salina para eliminar qualquer ar. Agora, induza anestesia em uma rata fêmea de 10 a 12 semanas de idade com isoflurano. Após a indução da anestesia, ajuste o nível de manutenção do isoflurano.

Posicione o animal em decúbito dorsal e coloque uma pequena máscara de anestesia feita a partir de uma seringa de 10 cc. Após a depilação do abdômen e a desinfecção da derme, prossiga com a cirurgia. A cirurgia a seguir é realizada tanto em ratos quanto em camundongos da mesma maneira.

Inicie realizando uma laparotomia mediana inferior para expor a bexiga. Em seguida, começa a parte mais crítica da cirurgia. Sob microscópio cirúrgico, posicione um ponto em bolsa de retalho no domo da bexiga utilizando fio monofilamento não absorvível 6-0.

Em seguida, utilizando uma agulha, realize uma pequena cistostomia dentro do ponto de sutura em bolsa de tabaco. Insira o cateter com manguito PE 50 através desse orifício. Tubos cateterizados mais finos, como o PE 10, podem apresentar uma resistência maior e mais variável, portanto não são recomendados.

Fixe o ponto de bolsa ao redor do tubo usando um nó cirúrgico. Em seguida, puxe suavemente o cateter para fora até que a ponta com manguito esteja diretamente sob a sutura. O segmento do cateter de calibre 18 é empurrado em direção à sutura para evitar vazamentos.

Verifique se há vazamentos entre o cateter e a bexiga. Com uma infusão suave de solução salina, aperte quaisquer vazamentos com pontos adicionais.

Agora, feche os músculos abdominais usando suturas de monofilamento, deixando uma passagem para o cateter na parte superior da incisão. Passe o cateter até a região interescapular utilizando uma haste metálica oca, evitando assim que os animais mordam o tubo. Após a cirurgia, a haste metálica deve ser posicionada sob a pele e acima dos músculos abdominais e dorsais.

Insira a haste subcutaneamente até a região interescapular do animal. Complete a cirurgia fechando os músculos abdominais e a pele com suturas monofilamentares não absorvíveis. Agora é muito importante verificar a permeabilidade e a estabilidade do cateter implantado, lavando-o com solução salina.

A solução de infusão deve sair da bexiga, percorrendo a uretra. Após administrar o analgésico por via subcutânea, feche a extremidade externa do cateter com uma película plástica e fixe o cateter à pele da região lombar do rato. Por fim, permita que o animal se recupere por 30 minutos.

Antes de iniciar a citometria, certifique-se de que os instrumentos foram devidamente calibrados. Coloque a rata em uma gaiola metabólica acima de um recipiente contendo óleo que repousa sobre uma balança digital. O próximo passo é conectar o cateter implantado a uma torneira de três vias por meio de uma cânula com conector tipo lure.

A cânula deve ser conectada ao transdutor de pressão e a uma bomba de infusão. O transdutor de pressão está ainda conectado, por meio de um amplificador, ao sistema de aquisição de dados e a um computador que utiliza um software de acesso público para iniciar as medições de controle, acionando a bomba de infusão para infundir solução salina na bexiga. Durante um período de 30 minutos, a gaiola metabólica é suspensa sobre uma balança digital, que é usada para estimar o volume urinado pela rata.

A pressão intravesical é registrada enquanto a bexiga se enche e esvazia. Na próxima etapa, os fármacos podem ser administrados por via sistêmica ou intravesical durante mais 30 minutos de coleta de dados. Quando o experimento for concluído, o animal deve ser sacrificado.

Um traçado típico da pressão em um rato mostra que, durante a infusão do fluido, ocorre um acúmulo lento da pressão na bexiga até que um determinado limiar seja atingido. Então, a bexiga contrai e o esfíncter urinário se abre, permitindo a passagem da solução instilada através da uretra. Dessa forma, a bexiga é esvaziada.

A contração irá parar e a pressão cairá novamente para o nível basal. Os dados coletados de um camundongo apresentam todas as mesmas características. A citometria foi utilizada para identificar os alvos moleculares do óleo de mostarda ou mo MO, um composto altamente reativo que há muito tempo tem sido usado em modelos experimentais de inflamação e hiperalgesia de órgãos viscerais, como a bexiga urinária.

Como esperado, uma infusão intravesical de 10 milimolares de MO induziu uma forte diminuição no intervalo contrátil em camundongos selvagens. Curiosamente, camundongos deficientes do receptor de MO TRPA A um apresentaram um resultado semelhante ao dos tipos selvagens sob as mesmas condições. Em contraste, MO induziu uma alteração muito mais fraca nos parâmetros sistêmicos em um camundongo com o gene TRPV um eliminado do que em camundongos selvagens; os duplos nulificados para ambos TRPA um e TRPV um foram quase irresponsivos à dose de MO.

Os dados sugerem que o TRP V1 pode desempenhar um papel fundamental na irritação visceral induzida pelo MO. A frequência média instantânea de micção antes e durante a infusão intravesical de MO apoia esses dados. A frequência média é relativa à infusão de solução salina.

Ao realizar este procedimento, é importante garantir que o cateter permaneça firmemente fixado à bexiga, para que não haja vazamento da solução infundida para o abdômen. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir a pressão intravesical, o que envolve a implantação de um cateter na bexiga e a colocação de animais acordados ou anestesiados em uma plataforma de citometria sob perfusão controlada da bexiga.