Avidez baseado Triagem Interação Extracelular (AVEXIS) para a detecção escalável de baixa afinidade Extracelular receptor-ligante Interações

O objetivo geral deste procedimento é descobrir novas interações proteicas extracelulares envolvidas em processos de reconhecimento celular, em particular proteínas receptoras inseridas na membrana. A abordagem AveXis foi projetada para contornar as afinidades de interação muito fracas que caracterizam essa classe de interações proteicas e o fato de que as proteínas de membrana são difíceis de manipular bioquimicamente. Isso é realizado primeiramente compilando uma biblioteca de proteínas recombinantes das regiões extracelulares de receptores de superfície celular.

Isso é conseguido por meio do planejamento de plasmídeos de expressão para produzir as regiões do domínio ecto dos receptores como fragmentos solúveis, tanto como iscas monoméricas biotiniladas quanto como pentâmeros marcados com enzimas. O segundo passo é expressar e normalizar as proteínas para que estejam prontas para a triagem de interações. Todas as proteínas são produzidas em células de mamífero para garantir que modificações pós-traducionais, como ligações dissulfeto, sulfeto e glicosilação, sejam adicionadas.

Uma etapa crucial do protocolo é garantir que as proteínas isca e presa dentro da biblioteca sejam todas normalizadas em níveis limiares. Em seguida, vem a parte empolgante: a triagem de novas interações. Os Bates são distribuídos em poços individuais de uma placa de microplaca e então testados quanto a interações utilizando a praise.

Em seguida, realiza-se uma etapa de lavagem. O passo final é adicionar o substrato para a enzima, a fim de detectar qualquer interação capturada nos arranjos de proteínas isca. Em última análise, os resultados de um ensaio VEX podem mostrar quais receptores de superfície celular são capazes de formar pares de ligação e, portanto, podem estar envolvidos nos processos de reconhecimento e comunicação entre células.

A principal vantagem desta técnica em comparação com métodos populares de extração de proteínas, como o teste de duplo-híbrido em levedura ou purificações bioquímicas, é que ela foi especificamente projetada para detectar interações extracelulares entre proteínas. É especialmente adequada para descobrir novas interações entre proteínas receptoras ancoradas à membrana. Essas interações são difíceis de detectar utilizando outras técnicas, porque as proteínas de membrana são bioquimicamente difíceis de manipular e, normalmente, suas interações com receptores complementares são extremamente fracas.

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave relacionadas à forma como as células reconhecem e se comunicam entre si. No nível molecular, pode ser utilizado para responder perguntas relativas a processos biológicos básicos, como quais proteínas receptoras presentes na superfície de óvulos e espermatozoides se ligam entre si, ou quais interações entre receptores e ligantes são responsáveis por comportamentos celulares, como a fusão de miócitos ou a formação da crista neural. O principal desafio com esta abordagem é compilar as bibliotecas de proteínas isca e presa nas quais será realizada a triagem de interações.

É também muito importante garantir que as proteínas isca e presa sejam normalizadas dentro dos níveis limite exigidos para o ensaio. Isso reduz a frequência de falsos negativos e falsos positivos. Tive a ideia inicial para este método durante meu doutorado, quando tentava identificar um parceiro de ligação para a proteína de superfície celular CD200.

Essencialmente, eu estava fazendo a pergunta: qual é o padrão de ligação para este determinado receptor de superfície celular? Mesmo hoje, essa continua sendo uma pergunta tecnicamente difícil de responder. Naquela época, no entanto, o genoma humano estava próximo da conclusão e percebi que, como agora dispúnhamos de uma lista completa de todos os receptores de superfície celular no genoma, poderíamos agora perguntar, dentro deste conjunto de proteínas receptoras, quais podem interagir tecnicamente.

Esta é uma pergunta muito mais fácil de responder, e o AveXis foi o método que desenvolvemos para respondê-la. Uma vez que uma biblioteca de vetores de expressão de isca e de presa tenha sido estabelecida, prepare-se para transfectá-los em células HEC 2 9 3 E, começando pelo semeamento das células no dia anterior à transfeção, numa densidade de 250.000 células por mililitro em 50 mililitros de meio freestyle 2 9 3, para garantir uma eficiente eluição por biotina. Suplemente o meio utilizado para produzir as proteínas de isca, e não as proteínas de presa, com d-biotina. Com todas as placas preparadas, incube as células durante a noite em condições padrão.

Como a biotina tem baixa solubilidade e solução precisa, preferimos pesar a biotina adicional e então adicioná-la ao meio, agitando vigorosamente no dia seguinte. Transfete 50 mililitros de células cultivadas com 25 microgramas do plasmídeo isca ou presa utilizando um reagente de transfeção apropriado para produzir iscas biotiniladas; realize cotransfeção do construto isca na proporção de 10 para 1 com plasmídeos que codificam uma forma secretada da proteína ELI biotin ligase por uma colheita.

Os cultivos cinco dias após a transfeção, primeiramente pela centrifugação das células a 3000 vezes a gravidade por 20 minutos e, em seguida, pela filtração do sobrenadante S através de um filtro de 0,22 mícron. Uma das características principais da AveXis é que, como as proteínas recombinantes são secretadas, elas podem ser diluídas ou concentradas até atingirem atividades limiares. Descobrimos que as proteínas recombinantes apresentam expressão variável até quatro ordens de magnitude, portanto, a etapa de normalização reduz a ocorrência de falsos positivos durante as etapas de triagem.

Para iniciar a normalização da isca, a biotina não conjugada deve ser removida do meio por diálise, pois competirá com a proteína de isca biotinilada pelos sítios de ligação à estreptavidina. Comece fixando a isca em um tubo de diálise. Para garantir uma diálise eficaz das proteínas recombinantes, verificamos que é importante fornecer uma área superficial em excesso ao tubo de diálise. Normalmente, utilizamos duas a três vezes mais tubo do que o estritamente necessário para o volume que está sendo submetido à diálise.

Por um período de 24 horas, diализou-se extensivamente a isca contra um tampão apropriado, como PBS, após a realização da diálise. Um ELIZA começa bloqueando as cavidades de uma placa microtitulável com estreptavidina com PBST contendo BSA por 15 minutos. Enquanto isso, em uma placa limpa, prepare uma série de quatro diluições de um para três das proteínas isca em PBST com 2% de BSA.

Após a incubação de 15 minutos, transfira a diluição para a placa com TTR strep e incube a placa por uma hora à temperatura ambiente. Após uma hora, lave as cavidades e, em seguida, adicione 100 microlitros de OX 68 a dois microgramas por mililitro a cada poço. Incube a placa à temperatura ambiente por mais uma hora. Após a segunda incubação, realize outra série de lavagens e carregue a placa com fosfatase alcalina anti-US.

Incube a placa por uma terceira hora em temperatura ambiente. Agora, lave a placa três vezes em PBST e realize uma lavagem final com PBS. Para remover qualquer detergente residual, adicione 100 microlitros de substrato a 1 miligrama por mililitro 1 0 4 em tampão de dietanolamina após uma hora.

À temperatura ambiente, meça a absorbância em 405 nanômetros. Uma série de diluição de quatro diferentes sobrenadantes de isca dialisados foi detectada por ELISA utilizando um anticorpo monoclonal anti-marca CD4. Se as proteínas de isca expressas não diluídas forem insuficientes para saturar todos os sítios de ligação da biotina em uma placa revestida com estreptavidina, concentre a proteína utilizando um concentrador Viva spin. Caso contrário, utilize a proteína de isca em uma concentração diluída em PBST com 2% de BSA.

Isso é suficiente para saturar o sítio de ligação da biotina do ensaio. Quantifique os níveis relativos de expressão das pré-proteínas utilizando a atividade da enzima beta-lactamase. Comece preparando uma série de diluições do sobrenadante contendo as paraproteínas em tampão PBST com 2% de BSA.

Em seguida, adicione 20 microlitros da diluição a 60 microlitros de uma solução de nitroso estepina carregada em uma placa. Transfira imediatamente a placa para um leitor de placas e meça a absorbância em 485 nanômetros a cada minuto pelos próximos 20 minutos usando concentradores centrífugos ou diluição de PBST com 2% de BSA. Ajuste a concentração final das amostras para hidrolisar todos os nitrosos no ensaio em cerca de sete minutos, o que equivale a cerca de duas voltas de nitrosos por minuto.

Inicie a tela AveXis lavando uma placa revestida com TAVR ENC strep em PBST e batendo a placa seca contra uma toalha de papel. Em seguida, adicione PBST com BSA a cada poço e incube a placa por 30 minutos. Isso bloqueia sítios de ligação proteica espúrios.

Dentro de cada poço, removeremos a solução bloqueadora com um movimento rápido do placa sobre uma pia e adicionaremos 100 microlitros da isca monomérica biotinilada normalizada aos poços apropriados. Incubar a placa por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, remover as amostras de isca da placa com outro movimento rápido e lavar três vezes com PBST.

Em seguida, tampe e seque após a terceira lavagem. Agora, adicione 100 microlitros do construto de presa pentamérico normalizado a cada poço e incube a placa à temperatura ambiente por uma hora. Após uma hora, realize mais três lavagens da placa com PBST e uma lavagem final apenas com PBS.

Por fim, adicione 60 microlitros da solução de nitrato sete a cada poço e incube a placa em temperatura ambiente por duas horas, ou, preferencialmente, incube as placas por 16 horas a quatro graus SIUs. No dia seguinte, as interações positivas terão ficado vermelhas. Tire uma fotografia da placa para registro visual e, em seguida, quantifique as reações em uma absorbância de 485 nanômetros utilizando um leitor de placas.

Após cerca de 10 minutos do início da reação de triagem da AveXis, foram observadas mudanças de cor de amarelo a vermelho tanto no controle de captura do alvo mediado por anticorpo quanto na interação do controle positivo. Essa mudança de cor indica a hidrólise do nitroso no substrato. Algumas interações positivas são observáveis nesta escala de tempo, mas a maioria levou algumas horas para aparecer.

Normalmente, observa-se uma taxa de acerto de cerca de 0,4 a 0,6% de positivos. Uma vez que as bibliotecas de proteínas são preparadas, a etapa de triagem desta técnica pode ser realizada rapidamente. É perfeitamente possível triar até 12 placas em um dia após a identificação de uma interação.

O próximo passo mais importante é, em primeiro lugar, demonstrar que a interação pode ser repetida utilizando preparações independentes e frescas das proteínas. Em segundo lugar, sempre determinamos se a interação é independente da orientação isco-presa, ou seja, se ela pode ser recíproca. Isso envolve clonar os domínios do vetor isco no vetor presa e vice-versa.

Considera-se que interações que podem ser repetidas e retribuídas são de alta confiança e sempre demonstraram ser positivas. Utilizando outras técnicas, como ressonância de plasmones de superfície, gostamos de usar a ressonância de plasmones de superfície para validar adicionalmente quaisquer interações que identificamos novamente. Importante, isso fornece uma demonstração de que os dois componentes purificados podem interagir diretamente e também pode ser usado para mostrar que a ligação é saturável e, portanto, específica.