Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

O objetivo geral deste procedimento é obter um acompanhamento padronizado do comportamento in vivo de células-tronco transplantadas no cérebro de camundongo. Isso é realizado primeiramente marcando as células estromais derivadas da medula óssea, que expressam simultaneamente EGFP e luciferase, com partículas fluorescentes de óxido de ferro de tamanho micrométrico. O segundo passo consiste em injetar adequadamente as BMCs marcadas com MPIO no tecido cerebral do camundongo.

Em seguida, a sobrevivência e a localização dos enxertos celulares são acompanhadas de forma não invasiva por meio de imagem de bioluminescência e imagem por ressonância magnética. O passo final consiste em validar os resultados de imagem in vivo utilizando análise histológica post mortem. Este método pode fornecer informações sobre o comportamento de células-tronco após o transplante no cérebro de camundongos, mas também pode ser aplicado a outros sistemas, como organismos modelo e estudos de doenças.

A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos envolvendo o manejo do animal são difíceis de aprender, já que injeções intravenosas e intracerebrais são complexas de realizar e apresentam certos riscos para a sobrevivência do animal. Para iniciar este procedimento, adicione 75 vezes 10 à sexta partículas de óxido de ferro de tamanho micrométrico azul glaciar a uma cultura celular em crescimento subconfluente. Incube-as por mais 16 horas para permitir a captação das partículas por endocitose, depois lave as partículas remanescentes.

Deixe as células crescerem por mais 24 horas para obter confluência celular e distribuição homogênea do G-B-M-P-I-O. Em seguida, utilize microscopia de fluorescência para validar visualmente a captação de partículas, calculando a proporção de células positivas para EGFP e G-B-M-P-I-O em relação ao número total de células positivas para EGFP. A seguir, lave as células de BMSC luciferase EGFP marcadas com G-B-M-P-I-O duas vezes com 10 mililitros.

Trate as células com tripsina EDTA e colete-as posteriormente. Em seguida, lave as células e re-suspenda-as em uma concentração final de 133 vezes 10 à sexta células por mililitro em PBS. Por fim, mantenha as células no gelo até o transplante.

Neste procedimento, anestesie o camundongo por injeção intraperitoneal da mistura de cetamina a 80 miligramas por quilograma e xilazina a 16 miligramas por quilograma. Aguarde cinco minutos até que o camundongo adormeça, então rape a cabeça para permitir manipulações estéreis. Em seguida, posicione o camundongo em um estereotáxico e desinfete a pele com álcool.

Após isso, aplique pomada nos olhos para prevenir desidratação. Faça uma incisão mediana no couro cabeludo para expor o crânio com o objetivo de atingir o hipocampo. Faça um furo no crânio a dois milímetros posterior e dois milímetros lateral utilizando uma broca odontológica.

Neste ponto, agite brevemente a suspensão celular em vórtex e, em seguida, aspire a suspensão celular na seringa. Posteriormente, abaixe a seringa com agulha até uma profundidade de 2,5 milímetros sob a dura-máter e permita a equilibração de pressão por um minuto. Após um minuto, retire a agulha para uma posição de dois milímetros sob a dura-máter.

Em seguida, injete três microlitros de suspensão celular utilizando uma bomba de microinjeção automatizada na velocidade de 0,70 microlitros por minuto. Após a injeção, aguarde mais cinco minutos para evitar refluxo da suspensão celular injetada. Em seguida, retire lentamente a agulha.

Em seguida, desinfete as bordas da pele e, então, feche a pele com pontos. Injete 300 microlitros de solução de cloreto de sódio 0,9% subcutaneamente para prevenir desidratação. No final, coloque o camundongo sob uma lâmpada de aquecimento para permitir a recuperação da anestesia antes de realizar a imagem de bioluminescência.

Anestesie o camundongo com uma mistura de 3%iso, flúor e oxigênio. Em seguida, coloque o camundongo no imageador de fótons. Reduza o nível de anestesia ajustando o flúor de isof para 1,5%. A seguir, injete d-Lucifer intravenosamente a 150 miligramas por quilograma de peso corporal.

Adquira a imagem durante cinco minutos utilizando o software Photo Vision. Em seguida, realize o processamento de imagem utilizando o software M Three Vision e quantifique o sinal observado utilizando regiões fixas de interesse. Para realizar a imagem por ressonância magnética, anestesie o camundongo com 3% de ISO-fluorano em uma mistura de oxigênio e óxido nítrico.

Em seguida, posicione o camundongo no restritor de um sistema de RM horizontal de 9,4 Tesla. Reduza o nível de anestesia ajustando o isoflurano para 1%. Aplique, então, pomada nos olhos do camundongo para prevenir desidratação. Depois disso, utilize uma sonda retal para monitorar a temperatura corporal.

Em seguida, posicione um sensor sob o ventre do camundongo para monitorar a frequência respiratória. Mantenha a frequência respiratória em 110 ± 10 vezes por minuto e mantenha a temperatura corporal constante dentro de uma faixa estreita de 37 ± 0,5 graus Celsius. Em seguida, coloque a bobina RF de superfície sobre a cabeça do camundongo.

Posicione o rato no centro do ímã. Em seguida, abra o ParaVision 5.1 e defina os parâmetros da sequência de acordo com o manuscrito anexo. Em seguida, adquira um conjunto de 10 imagens coronais ponderadas em T2 por eco de spin para obter informações anatômicas específicas.

Imagens de eco de gradiente ponderadas em T2* para estudar a migração de células-tronco com uma resolução no plano de 70 micrômetros quadrados. Nesta etapa, sacrifique o camundongo e remova o cérebro. Fixe o tecido cerebral à temperatura ambiente em paraformaldeído 4% em PBS por duas horas.

Após duas horas, desidrate o tecido cerebral colocando-o em diferentes gradientes de sacarose a quatro graus Celsius. No dia seguinte, congele o tecido cerebral usando nitrogênio líquido e armazene o tecido a menos 80 graus Celsius até o corte, quando estiver pronto.

Seccione o tecido cerebral em cortes com espessura de 10 micrômetros utilizando um criostato. Em seguida, examine sob microscópio de fluorescência os cortes criostáticos não corados para detectar a fluorescência azul das partículas G-B-M-P-I-O e a fluorescência verde das células que expressam EGFP. Em seguida, examine os cortes criostáticos não corados quanto à fluorescência de fundo verde-vermelha proveniente das células inflamatórias.

O procedimento descrito de marcação com MPIO azul-gelado resulta em marcação altamente eficiente de células BMSC, luciferase EGFP, que pode ser facilmente validada por microscopia de fluorescência. Em seguida, após o enxerto de BMSC marcadas com G-B-M-P-I-O, células luciferase EGFP no SNC de camundongos, a sobrevivência do enxerto celular pode ser monitorada por imagem de bioluminescência in vivo com base na atividade da luciferase. Além disso, a localização exata das células enxertadas pode ser monitorada por imagem de ressonância magnética in vivo com base no teor de ferro do MPIO azul-gelado.

Por fim, a análise histológica mostra a validação dos resultados obtidos por imagem de bioluminescência e imagem por ressonância magnética. A sobrevivência estável foi confirmada por uma expressão estável de EGFP ao longo do tempo após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de imagem molecular explorarem eventos celulares e moleculares após o transplante de células-tronco em diferentes modelos animais de doenças neurodegenerativas.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar imagens moleculares, aplicando bioluminescência e ressonância magnética, e validar adequadamente os resultados in vivo utilizando avaliação histológica post mortem.