Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados

O objetivo geral deste procedimento é registrar as respostas de unidades individuais in vivo a partir de uma população identificada de neurônios em um sistema modelo não genético. Isso é realizado primeiramente realizando uma craniotomia para expor a região cerebral de interesse. O segundo passo é usar fios de tungstênio para depositar o corante fluorescente na região para a qual os neurônios-alvo projetam.

Em seguida, o corante é transportado de forma retrógrada, resultando na marcação seletiva dos neurônios de projeção. O passo final consiste em realizar a gravação a partir do axônio marcado do neurônio de projeção individual. Em última análise, gravações extracelulares de unidade única são utilizadas para demonstrar como os neurônios sensoriais centrais em um circuito intacto respondem à estimulação sensorial em evo.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre como os circuitos neurais detectam diferenças de submilissegundo no tempo de chegada das entradas sinápticas. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é a capacidade de direcionar neurônios individuais ou até mesmo axônios e sistemas não acessíveis geneticamente. Peixes elétricos semanais utilizam sinais elétricos para comunicação e navegação.

Eles distinguem sinais de diferentes peixes utilizando diferenças de submilissegundo no tempo de chegada das entradas sinápticas. Investigamos como os neurônios comparadores de tempo presumidos em seu circuito sensorial eletrossensorial são capazes de detectar tais pequenas diferenças temporais. No entanto, esta técnica também pode ser aplicada a outros sistemas, como vias sensoriais visuais e auditivas.

É particularmente difícil obter líquido dessas células devido ao pequeno tamanho, ao denso emaranhado no tecido circundante e aos terminais pré-sinápticos que cobrem a maior parte do corpo celular. A injeção intracelular de corante durante um registro em célula inteira. In vitro rotula uma única célula para orientar registros direcionados a partir do axônio. De forma semelhante, o transporte retrógrado após injeção extracelular de corante fornece um meio de rotular seletivamente os neurônios projetores em regiões superficiais do cérebro.

Isso pode ser usado para fornecer orientação visual para gravações de unidade única in vivo. Para preparar a agulha codificada com D, primeiro afie eletroliticamente um fio de tungstênio com diâmetro de 160 micrômetros até o diâmetro final da ponta da agulha de cinco a 50 micrômetros. Em seguida, na noite anterior ao experimento, marque a ponta da agulha com uma solução de dois milimolares de corante Alexa floor conjugado à dextrana de peso molecular 10.000 para induzir anestesia geral.

Coloque o peixe na água do aquário com solução MS 222 a 300 miligramas por litro para imobilizar e silenciar eletricamente o peixe, injetando 100 microlitros de flail a três miligramas por mililitro na musculatura dorsal do corpo. Em seguida, preencha a câmara de registro com água do aquário e posicione o peixe com o lado ventral voltado para baixo sobre a plataforma no centro da câmara. Então, administre a solução MS 222 arejada a 100 miligramas por litro em uma a duas mililitros por minuto, colocando a ponta de uma pipeta na sua boca.

Posteriormente, estabilize o peixe com hastes fixas e cera em ambos os lados do corpo. Monitore a condição de saúde do peixe verificando o fluxo sanguíneo contínuo nos vasos oculares e a coloração normal do corpo. Em seguida, gire a plataforma ao longo do eixo vertical.

Ajuste uma extremidade da plataforma de modo que um lado da superfície dorsal da cabeça do peixe fique exposto acima da água, enquanto o restante do corpo do peixe permanece submerso. Coloque um pequeno pedaço de lenço de papel Kim em qualquer parte da pele não submersa para evitar ressecamento. Neste procedimento, aplique lidocaína a 0,4% na superfície exposta da cabeça usando um cotonete.

Em seguida, use uma lâmina de bisturi para cortar um pedaço retangular de tecido cutâneo de aproximadamente três milímetros por cinco milímetros para um peixe de 6,2 centímetros. A borda lateral do retângulo deve alinhar-se com o centro do olho. A borda anterior do retângulo deve ficar logo posterior ao olho, e a borda medial do retângulo deve ficar logo lateral à linha média.

Posteriormente, remova o retângulo usando um par de pinças. Corte um quadrado adicional de 2,5 milímetros na região anterior para expor o crânio. Limpe completamente a superfície exposta do crânio raspando qualquer tecido em excesso com a lâmina do bisturi.

Em seguida, seque completamente a superfície com um lenço Kim e ar forçado. Depois, cole um pino metálico à região exposta do crânio medial anterior com cola instantânea. Aguarde até que a cola esteja completamente seca.

Use uma broca dentária com ponteira de carbeto em formato de bola com diâmetro de 0,5 milímetro para desenhar um retângulo de aproximadamente dois milímetros por quatro milímetros sobre o crânio de um peixe de 6,2 centímetros. Em seguida, corte o perímetro do retângulo com o bisturi e a pinça. Depois, remova o crânio.

Para expor o cérebro, corte a dura-máter pigmentada e a pia-máter transparente utilizando uma tesoura de mola ou uma agulha. Em seguida, remova as partes cortadas com uma pinça para expor o núcleo extra lateral anterior e o núcleo extra lateral posterior. Posicione agora um manipulador com uma agulha revestida com D, preparada anteriormente, acima da região-alvo contendo os axônios de interesse.

O núcleo extra lateral posterior, em nosso caso, insere rapidamente a agulha aproximadamente 25 micrômetros no tecido. Após a difusão do corante por 15 a 30 segundos, retire a agulha. Repita o procedimento com agulhas novas adicionais conforme necessário.

Coloque cada um em um local diferente para que o corante seja distribuído por toda a região-alvo. Em seguida, lave o corante em excesso da cavidade com solução de Ringer de Hickman e aguarde pelo menos duas horas para a captação e transporte do corante. Para visualizar os axônios de interesse, posicione a câmara de registro com o peixe sob a objetiva de um microscópio de fluorescência epiluminiscente com platina fixa e posição vertical.

Substitua a solução de respiração por água fresca do tanque e mantenha a mesma taxa de fluxo. Em seguida, coloque uma extremidade do fio terra na cavidade cerebral exposta e conecte a outra extremidade ao terra do estágio de registro. A seguir, posicione um par de eletrodos de registro próximo à base da cauda.

Em seguida, conecte os eletrodos a um amplificador diferencial e a um dispositivo de gravação. Para monitorar o comando de descarga do órgão elétrico ou EODC, prepare um esboço em escala da região do cérebro visualizada em baixa ampliação, incluindo os principais vasos sanguíneos como pontos de referência para identificar a localização exata dos axônios marcados. Para confirmar primeiro a colocação de D, visualize todo o tecido com iluminação de campo claro para orientação.

Em seguida, visualize-o com iluminação fluorescente. O núcleo extra lateral posterior deve apresentar marcação difusa. Depois disso, sob alta ampliação, localize o núcleo extra lateral anterior utilizando os vasos como pontos de referência.

Illumine-o com luz fluorescente enquanto procura um axônio marcado próximo à superfície, utilizando um capilar de vidro de borossilicato com filamento, com diâmetro externo de um milímetro e diâmetro interno de 0,58 milímetro. Puxe um eletrodo de registro com um haste estreita de cinco milímetros de comprimento e diâmetro da ponta entre um e 2,4 micrômetros.

Encha o eletrodo com solução de Ringer filtrada de Hickman. A resistência final da ponta deve estar na faixa de 16 a 155 megaohms. Coloque o eletrodo em um suporte de eletrodo com uma porta de pressão.

Conecte-o ao estágio da cabeça montado em um micromanipulador. Em seguida, conecte o estágio da cabeça a um amplificador. Um dispositivo de aquisição analógico-digital não mostrado conecta o amplificador ao computador.

Em seguida, aplique uma pressão positiva de 30 milibares à linha do eletrodo. Avance lentamente o eletrodo em direção ao axônio a partir da superfície do tecido. Quando o eletrodo estiver próximo ao axônio, a pressão positiva deve causar um movimento ligeiro, mas perceptível, do axônio enquanto o eletrodo estiver ao lado dele.

Registre a atividade durante a apresentação dos estímulos de teste. Embora um artefato elétrico confirme a gravação e estimulação adequadas, não deverá haver potenciais de ação. Libere a pressão para fora no eletrodo e repita a estimulação e o registro.

Em seguida, aplique uma leve sucção, fazendo com que o axônio se mova para dentro do eletrodo. Repita a estimulação e a gravação novamente. Agora você deverá observar alguns potenciais de ação em resposta às estimulações.

Uma vez que os potenciais de ação sejam visíveis, feche a linha de pressão. Quando todas as gravações desejadas estiverem concluídas, troque a água do tanque novamente pela solução de ressurgência com MS 222 a cem miligramas por litro para garantir que o peixe esteja completamente anestesiado. Nenhum EODC deve ser detectado por pelo menos 10 minutos antes de eutanasiar o peixe.

Aqui estão cinco traços de exemplo mostrando os potenciais de ação evocados por um estímulo quadrado transversal monofásico contralateral positivo de 0,1 milissegundo e seis milivolts por centímetro, e aqui está um gráfico em raster mostrando os tempos de pico durante 20 repetições de uma janela de gravação de 75 milissegundos para a mesma unidade estimulada nos tempos zero com estímulos de seis milivolts por centímetro. A faixa de durações está listada à direita. É mostrada aqui uma curva de sintonia de duração do estímulo que quantifica as respostas em picos por repetição do estímulo.

Uma vez dominada, a cirurgia e a injeção do corante mostradas nesta técnica podem ser realizadas em uma hora, se executadas corretamente, e os registros podem ser iniciados duas a três horas após a injeção do corante. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de monitorar cuidadosamente a saúde do animal experimental após o procedimento. Outros métodos, como a imagem de dois fótons, podem ser realizados para registrar atividade de neurônios em estruturas cerebrais ainda mais profundas.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como rotular e registrar respostas de unidade única de uma população identificada de neurônios.