Desenvolvimento de bronquiolite obliterante em um modelo murino de transplante de pulmão ortotópico

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer um modelo de bronquiolite obliterante que espelhe o transplante ortotópico de pulmão. Isso é realizado primeiramente colhendo o pulmão doador de um camundongo C57BL/10. O segundo passo é preparar o anel para a anastomose da brônquio, artéria pulmonar e veia.

Em seguida, o pulmão doador preparado é transplantado em um camundongo receptor C cinco sete BL seis. O passo final consiste em observar o camundongo transplantado por 21 ou 28 dias após o transplante. Por fim, a análise histológica é utilizada para demonstrar lesões de bronquiolite obliterante no pulmão transplantado.

A principal vantagem deste modelo, em comparação com o modelo de transplante heterotópico com espelhamento, é que o modelo atual simula a condição humana. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque as estruturas superiores em camundongos são muito delicadas e mais suscetíveis a lesões, já que possuem apenas um décimo da massa do rato. Coloque o camundongo doador em uma câmara de contenção fechada e induza anestesia com 5% de isoflurano. Em seguida, use o cateter intravenoso de calibre 20 para entubar o camundongo ou traqueia, e então conecte-o a um ventilador de roedor.

Mantenha a anestesia com 1 a 2% de isoflurano. Após confirmar que o camundongo está completamente anestesiado pela ausência de resposta ao movimento da cauda e à pinça no dedo do pé, posicione-o em decúbito dorsal e prepare o abdômen com álcool 70%. Em seguida, corte a pele sobrejacente ao abdômen com uma tesoura e exponha a musculatura abdominal.

A seguir, realize uma esternotomia lapar, fazendo inicialmente uma incisão mediana através da parede abdominal e, em seguida, cortando transversalmente o esterno; afaste os intestinos e localize a veia cava inferior, que está logo abaixo do fígado. Injete heparina a 100 microlitros por quilograma na VCI. Em seguida, puxe para baixo o ligamento falciforme do fígado e corte o diafragma ao longo da inserção ventral caudal em direção à coluna vertebral.

Corte ambos os lados da parede torácica até o pescoço para expor a cavidade torácica. Corte bilateralmente a caixa torácica protegendo o pulmão e remova o timo. Em seguida, corte a veia cava inferior intratorácica ao nível do diafragma.

Agora localize o coração e resseque o apêndice atrial direito. Em seguida, faça uma incisão transversal na raiz do tronco da artéria pulmonar e use a incisão para lavar os pulmões com dois mililitros de solução de Ringer lactato gelada e 0,1 mililitro de heparina. Exponha a traqueia e, então, corte-a juntamente com o esôfago.

Agora interrompa a ventilação em dois terços da insuflação final. Resseque o coração em bloco longo e armazene-o em gelo. Coloque gaze sobre o pulmão ressecado para protegê-lo da luz.

Incise o ligamento pulmonar até a veia pulmonar ou vp. Remova o esôfago e a aorta para localizar o hilo. Encontre a artéria pulmonar ou ap, que está localizada no aspecto mais cranial do hilo e no brônquio principal anexo.

Disseque cuidadosamente a artéria pulmonar longe do brônquio. Agora, confeccione uma braçadeira para a artéria pulmonar (PA) a partir de um cateter intravenoso de calibre 24, cortando-o com 0,5 milímetros de comprimento e uma extensão de 0,7 milímetros. A superfície da braçadeira é trançada AB.

Para fornecer uma superfície para anastomose, confeccione uma cânula para o brônquio utilizando material semelhante ao da cânula da artéria pulmonar, mas usando um cateter de calibre 20 cortado com um comprimento de um milímetro e uma extensão de 0,7 milímetros. O tamanho da cânula da veia pulmonar varia conforme o peso do camundongo doador. Para camundongos com peso entre 24 e 27 gramas.

O tamanho do cateter é 22 gauge, com comprimento de 0,7 milímetro e extensão de 0,7 milímetro, para camundongos pesando entre 27 e 32 gramas. Os comprimentos são os mesmos, mas utiliza-se um cateter 20 gauge. Agora, insira os cateteres na porção distal do hilo da artéria pulmonar, veia pulmonar e brônquio, fixando cada um com sutura de seda 9-0.

Depois que as braçadeiras forem corretamente fixadas, envolva o pulmão doador preparado em gaze embebida em solução de Ringer lactato e coloque-o sobre gelo até o transplante. Para preparar o camundongo receptor, induza anestesia e coloque-o em ventilação mecânica da mesma maneira utilizada para o doador.

Raspe a parede torácica esquerda e prepare com álcool a 70%. Comece fazendo uma incisão toracotômica no terceiro espaço intercostal esquerdo. Estenda a incisão dorsalmente, próximo à coluna vertebral.

Certifique-se de que o campo cirúrgico esteja coberto de maneira estéril e coloque um grampo para microvasos nos vasos pulmonares esquerdos e no brônquio adjacentes ao coração. A artéria pulmonar pode ser visualizada na região cranial, a veia pulmonar na extremidade caudal do hilo e o brônquio entre eles. Em seguida, aplique tração suave com uma pinça hemostática para causar leve tensão na pa, PV e no brônquio.

Mantenha as estruturas hilares presas com pinça e resseque cuidadosamente o pulmão esquerdo. Isole a artéria pulmonar, a veia pulmonar e o brônquio, e em seguida coloque uma sutura ao redor de cada estrutura de forma frouxa. Disseque completamente a artéria pulmonar de sua bainha adventicial e, então, faça uma pequena incisão transversal de aproximadamente um quarto da circunferência do vaso na parede anterior.

Enquanto mantém intacta a continuação da parte dorsal da artéria, obtenha o pulmão doador, que é envolvido em gaze de algodão fria embebida em solução de Ringer lactato, e posicione-o na cavidade torácica. Em seguida, insira as luvas nos PA, VP e brônquio do receptor para criar anastomose e ligue-as com sutura nano. A seguir, remova o pulmão do receptor.

Em seguida, remova o grampeamento hilar cruzado, o que permite a reperfusão e ventilação. Posicione o pulmão transplantado de volta na caixa torácica do receptor e feche a incisão da toracotomia. Usando sutura 5-0, o camundongo agora deve se recuperar da anestesia. A buprenorfina pode ser administrada para alívio da dor após o camundongo ter recuperado a consciência.

Esta tabela mostra os escores histológicos de rejeição aguda e a prevalência de bronquiolite obliterante ou OB. A pontuação da rejeição aguda após o transplante é denominada escore A. As combinações de aloenxertos apresentam consideravelmente mais patologia de rejeição aguda ou crônica quando comparadas ao enxerto ISO. Além disso, a prevalência de bronquiolite obliterante foi significativamente maior nas combinações de aloenxertos do que no enxerto ISO aos 21 e 28 dias após o transplante.

As alterações macroscópicas e a histopatologia aos 28 dias após o transplante pulmonar são mostradas aqui. Essas imagens representam as alterações macroscópicas e o enxerto pulmonar corado com H e E do ISO, bem como o pulmão direito ingênuo. Essas imagens representam cortes corados com H e E e com tricrômio de Masson de enxertos pulmonares de camundongo BL10 transplantados em receptores camundongos BL6, que desenvolveram OB e não OB, respectivamente.

A seta branca em um B identifica as lesões de OB. Este painel mostra seis enxertos pulmonares BL transplantados em um receptor camundongo BL 10 uma vez dominado. Esta técnica pode ser realizada em quase meia hora se for executada corretamente.

A utilidade desta técnica é que ela pode ser utilizada para responder perguntas mecanicistas sobre disfunção primária do enxerto, rejeição aguda e bronquiolite obliterante após transplante pulmonar.