Controlando o tamanho, forma e estabilidade de Polímeros Supramoleculares na Água

O objetivo geral do experimento a seguir é controlar o tamanho, a forma e a estabilidade de nanopartículas dinâmicas supramoleculares em água. Isso é alcançado pelo design de amplificações dicróticas que se auto-organizam ou polimerizam, cuja estrutura molecular é projetada para apresentar interações atrativas e repulsivas. Isso resulta em um mecanismo de crescimento frustrado, gerando nanopartículas auto-organizadas em água com forma esférica controlada.

Como segundo passo, aumenta-se a concentração de sal na solução aquosa, o que enfraquece as interações repulsivas codificadas na estrutura molecular do disco anfifílico. Isso induz uma transição de esfera para bastão, sendo investigações espectroscópicas de dicromismo circular dependentes da temperatura, ou CD, realizadas para revelar os mecanismos subjacentes a essa transição de esfera para bastão. Além disso, uma combinação de técnicas analíticas, como microscopia eletrônica de transmissão criogênica e ressonância magnética nuclear, é utilizada para medir e visualizar a transição de um tipo de agregado para outro. Os resultados obtidos demonstram que a transição de esfera para bastão se expressa em uma maior cooperação na polimerização supramolecular.

Isso se origina em uma transição de um processo anti-cooperativo em nanopartículas de tamanho restrito para um mecanismo totalmente cooperativo de nucleação e alongamento, que leva, neste caso, à formação de polímeros supramoleculares muito grandes, ou seja, nano bastões dinâmicos. A principal vantagem de combinar técnicas espectroscópicas como espectroscopia de dicroísmo circular, espalhamento de raios X a pequeno ângulo e RMN com técnicas microscópicas como criomicroscopia é que isso permite medir e visualizar transições de polímeros supramoleculares em água. Esses polímeros dinâmicos podem responder a estímulos externos, como alterações na temperatura, na força iônica ou no pH.

A combinação desses métodos é amplamente aplicável e pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas da química molecular e de nanomateriais auto-organizados. Por exemplo, pode-se investigar a correlação entre as dimensões dos agregados formados pela auto-organização de blocos construtores moleculares pequenos e os mecanismos subjacentes de formação. As implicações dessa metodologia estendem-se a uma ampla gama de aplicações biotecnológicas em nanoescala.

Tem sido particularmente interessante a área de imagem biomédica e o desenvolvimento de agentes de contraste nano particulados autoagregados, em que um equilíbrio delicado entre a estabilidade do agregado, o alto contraste e a capacidade de excreção dos agentes de contraste autoagregados é de importância fundamental para o seu sucesso no uso clínico. Tivemos inicialmente a ideia de combinar técnicas de caracterização ao perceber que mudanças sutis na estrutura molecular dos blocos constituintes autoagregáveis podem levar a diferenças fundamentais no mecanismo de polimerização supramolecular. O procedimento será demonstrado por Paul Beaumont, especialista e responsável pelas instalações de criomicroscopia de 10 no Instituto Tecnológico de Trovan.

Inicie este protocolo preparando uma solução de gadolínio DTPA com BTA em tampão citrato 100 milimolar, conforme descrito no protocolo escrito. Junto com este vídeo, encha uma cubeta UV Q de um centímetro com a solução. Insira a cubeta no suporte da qve no espectrômetro circular D crowism.

Meça um espectro de CD de 230 a 350 nanômetros. Em seguida, meça uma curva de resfriamento de CD na banda de CD de maior intensidade, de 363 a 283 kelvins, a uma taxa de um kelvin por minuto. Depois, adicione o mesmo volume de solução tampão de cloreto de sódio 2 molar à solução tampão de citrato de BTA gadolínio DTPA.

Isso aumentará a força iônica para um molar de cloreto de sódio e diluirá os discos à metade da concentração. Vortexe a solução com força iônica aumentada por 40 segundos após o aumento da força iônica, e remeça um espectro de CD de 230 a 350 nanômetros. Em seguida, meça uma curva de resfriamento de CD na faixa de CD de maior intensidade de 363 a 283 kelvin a uma taxa de um kelvin por minuto.

Exporte os dados brutos de CD para o Origin 8.5. Normalize os espectros definindo o efeito de CD na temperatura mais alta medida como igual a zero, e o efeito de CD na temperatura mais baixa medida como igual a um, uma vez que a magnitude do efeito de CD é proporcional ao grau de agregação; assim, as curvas de CD normalizadas são proporcionais ao grau de agregação. Os dados normalizados são ajustados utilizando a opção de ajuste de curva não linear no Origin Pro 8.5 com um modelo de autoagregação dependente da temperatura.

Neste modelo, distinguem-se um regime de nucleação e um regime de alongamento. Primeiro, ajuste o grau de agregação no regime de alongamento. Nesta equação, T representa a temperatura variável.

PHI N é a helicidade líquida, que é proporcional ao grau de agregação, e HE é a entalpia molecular de alongamento. T TE representa a temperatura de alongamento, que é a temperatura na qual a autoagregação começa a se tornar termodinamicamente favorável. O fator de normalização fiat é introduzido para garantir que Phi N dividido por fiat não exceda a unidade, o que decorre da restrição de que o grau de agregação não pode exceder.

O ajuste de Unity permite extrair a entalpia de alongamento em joules por mol e a temperatura de alongamento em Kelvin, que caracterizam a autoagregação das moléculas para uma determinada concentração. Ao realizar o ajuste, deve-se obedecer à restrição de que apenas o grau de agregação em temperaturas abaixo de TE deve ser ajustado, pois a equação é válida somente no regime de alongamento; após ajustar a primeira equação, o único parâmetro desconhecido na equação do regime de nucleação é a constante de ativação ka, que descreve a cooperação da polimerização supramolecular. Para determinar a constante de ativação ajustada, utilize o grau de agregação experimentalmente obtido para temperaturas acima de TE no regime de nucleação.

Inicie preparando as soluções para microscopia eletrônica conforme descrito no texto. Prepare brevemente dois tampones: um tampão citrato 100 milimolar e um tampão citrato 100 milimolar com cloreto de sódio 5 molar. Dissolva BTA de gadolínio DTPA em 0,1 mililitros de cada um dos tampones preparados para obter uma concentração final de 1 milimolar. Em seguida, submeta uma grade de folha de quanti revestida com carbono a tratamento com plasma utilizando um C Resington 2 0 8 carbon coer operando a 5 miliampères por 40 segundos.

O procedimento de vitrificação é uma etapa crucial da criomicroscopia, pois garante que uma camada fina de ISIS brilhante produzida seja adequada para análise por TAM. A solução aquosa é aplicada na grade durante a vitrificação em um vitrobot automatizado FEI. Isso envolve a aplicação da amostra na grade, a remoção do líquido em excesso para criar uma película fina da solução aquosa na grade e a subsequente vitrificação por imersão rápida da grade em etano líquido.

Após a vitrificação, transfira a grade tratada para nitrogênio líquido para preservá-la, em seguida transfira manualmente a grade da amostra para um cassete de autoloading, que também é resfriado com nitrogênio líquido. O próximo passo é inserir o cassete no TUE Cryo Titan, carregador automático de MET. O TUE Cryo Titan é equipado com uma fonte de emissão de campo operando a 300 quilovolts.

A gravação das imagens de TAM exige experiência e manipulação rápida. Isso porque o feixe de elétrons de alta energia danifica o espécime durante a obtenção das imagens. Registre as imagens usando uma câmera CCD equipada com um filtro de energia pós-coluna. Como o gadolínio é altamente paramagnético e os sinais de prótons seriam assim significativamente alargados, foi utilizado um disco diferente no qual o gadolínio foi substituído pelo itrio diamagnético e uma solução de atrato de BT.

Prepara-se o DTPA. Calcule quantos miligramas de DTPA de BT átrio, com peso molecular de 2.979 gramas por mol, são necessários para atingir uma concentração-alvo de um milimolar. Prossiga dissolvendo a quantidade determinada de DTPA de BT átrio em tampão succinato desuterado 50 milimolar em D₂O após pipetar 0,6 mililitros da solução resultante em um tubo de RMN de LABAs Wilm.

Insira a amostra em uma unidade variante do espectrômetro Nova 500 equipado com uma sonda I-D-P-F-G de cinco milímetros da Varian. Realize os experimentos DOI conforme discutido no texto, após registrar uma RMN padrão de prótons, adaptando o pulso de 90 graus e otimizando os tempos de mistura de acordo. A sequência de pulso única DOI é utilizada após determinar a autodifusão de HDO na sonda de referência ovariana, e na amostra o coeficiente de difusão dos agregados é determinado, a partir do qual o raio hidrodinâmico pode ser calculado.

Por fim, calcule os raios hidrodinâmicos RH dos agregados utilizando a relação de Stokes-Einstein para a difusão de uma partícula esférica. O caráter iônico dos complexos periféricos de gadolínio DTPA introduz frustração no crescimento unidimensional dos monômeros em disco, cujo núcleo é projetado para polimerizar em agregados alongados semelhantes a bastonetes. O equilíbrio entre interações atrativas e repulsivas controla o tamanho e a forma dos agregados.

Uma técnica poderosa para determinar o tamanho e a forma de partículas em solução é a fonte de sincrotrão. A dispersão de raios X em pequeno ângulo ou sucks. O DTPA de gadolínio BTA foi dissolvido em solução tampão de citrato e os perfis sucks foram registrados em duas concentrações diferentes.

Uma inclinação próxima a zero na região de baixo Q indica ausência de forma definida e isotropia no agregado, sugerindo a presença de objetos esféricos. Os dados medidos em diferentes concentrações foram ajustados utilizando um fator de forma esférico monodisperso homogêneo, resultando em um raio calculado de 3,2 nanômetros. O raio geométrico calculado do disco monomérico, BTA gadolínio DTPA, é de 3,0 nanômetros, o que, juntamente com a presença de agregados com razão de aspecto próxima a um, fornece evidência adicional sobre a forma esférica e o tamanho em escala nanométrica dos objetos autoagregados.

A espectroscopia de RMN ordenada por difusão de prótons foi realizada. A RMN de DOI permite a determinação dos coeficientes de difusão dos agregados supramoleculares, a partir dos quais pode-se calcular o raio hidrodinâmico. O coeficiente de difusão do agregado diastérmico diamagnético em um tampão succinato deutério foi determinado como 0,69 vezes 10 à potência menos 10 metros quadrados por segundo por meio da relação de Stokes-Einstein.

Um raio hidrodinâmico de 2,9 nanômetros foi calculado para os objetos discretos de formato esférico. Esse tamanho apresenta excelente concordância com o valor obtido a partir dos dados de SOX para o gadolínio BTA DTPA. Mais evidências de controle bem-sucedido sobre o comprimento da pilha unidimensional foram obtidas a partir de micrografias de TEM criogênica.

O agente de contraste gadolínio DTPA produz os objetos esféricos esperados com diâmetros próximos a seis nanômetros em uma concentração de um milimolar, o que confirma os resultados das medidas de so e DOI. A formação de polímeros supramoleculares em forma de bastão com alta razão de aspecto é claramente observada em micrografias de criomicroscopia eletrônica em alta força iônica. O blindagem eletrostática é a explicação mais provável para esse achado.

A forma muda de um agregado esférico de cerca de seis nanômetros de diâmetro para bastões alongados com diâmetro de seis nanômetros e comprimento de até várias centenas de nanômetros. Os espectros de CD à temperatura ambiente do BTA gadolínio DTPA com aumento da concentração de sal são mostrados aqui. A concentração do BTA gadolínio DTPA é de oito vezes 10 à potência menos três milimolar em baixa força iônica e quatro vezes 10 à potência menos três milimolar em alta força iônica.

Embora uma concentração significativamente mais baixa seja aplicada nas medições de CD, o efeito cotton nítido indica a presença de agregados intactos mesmo em concentrações micromolares. A forma do espectro de CD muda com o aumento da concentração de sal, o que é um bom indicativo de interações repulsivas reduzidas na periferia das pilhas e maior empacotamento dos decos. Além disso, as curvas de resfriamento de CD das mesmas soluções mostram diferenças distintas na forma.

A temperatura na qual a agregação começa desloca-se para temperaturas mais altas com o aumento da concentração de sal. Um mecanismo cada vez mais cooperativo também se torna evidente, caracterizado por um aumento mais acentuado no efeito de CD, enquanto a curva de resfriamento na ausência de cloreto de sódio é melhor descrita por um modelo ISO de autoagregação indicativo de um processo anti-cooperativo. A curva de resfriamento em 1,0 molar de cloreto de sódio é típica de um processo cooperativo de autoagregação e pode ser descrita por um modelo de nucleação e alongamento, que quantifica os parâmetros termodinâmicos da autoagregação de BTA gadolínio DTPA na ausência e na presença de um molar de cloreto de sódio.

Utilizando um modelo cooperativo, observa-se claramente a diminuição de ka, que é a constante adimensional de ativação. Valores mais baixos de KA indicam um maior grau de cooperação no processo de autoagregação, o que se expressa na formação de polímeros supramoleculares altamente alongados. Conforme observado em criomicroscopia eletrônica de transmissão, ao aplicar as técnicas experimentais demonstradas, é importante lembrar que apenas uma combinação de métodos experimentais levará a uma descrição global significativa dos nanomateriais dinâmicos em estudo.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de quão amplamente aplicável é a nossa abordagem experimental combinada e de como ela pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de nanomateriais auto-organizados e super poemas.