Diferenciação de células Dirigido tronco pluripotentes induzidas no sentido de Linfócitos T

O objetivo geral deste procedimento é gerar e caracterizar linfócitos T a partir de células-tronco pluripotentes induzidas ou células IPS. As células IPS podem então ser diferenciadas in vitro em um sistema de cultura OP9-DL1 e posteriormente amadurecidas in vivo em um camundongo deficiente para rag. Alternativamente, as células podem ser geneticamente modificadas para superexpressar o TCR OT-I e então transferidas adotivamente para desenvolvimento in vivo.

Após seis semanas de diferenciação in vivo, os camundongos podem ser desafiados por injeção intraperitoneal com sete células tumorais EEG e, em seguida, a especificidade antigênica das células T derivadas de IPS pode ser avaliada. Em última análise, as células IPS podem se diferenciar em células T convencionais e específicas para antígenos, sendo estas últimas capazes de proteger os animais contra o desafio tumoral. As implicações dessa técnica estendem-se para a imunoterapia contra o câncer individualizada.

O método permite a geração de grande quantidade de linfócitos T reativos a tumores a partir de uma quantidade mínima de sangue ou tecido cutâneo do paciente. No dia zero, transfira cinco vezes 10 à quarta potência de células IPS para uma placa de cultura de 100 milímetros contendo uma monocamada confluente de células OP9-DL1 em meio alfa MEM com 20% de FBS. No dia cinco, faça a tripsinização. Em seguida, centrifugue as células após incubá-las em uma placa de cultura fresca de 100 milímetros por 30 minutos em incubadora a 37 graus Celsius. Plaque cinco vezes 10 à quinta potência das células em suspensão em meio alfa MEM com 20% de FBS e ligante de FLT3 murino em uma nova placa de cultura de 100 milímetros contendo uma monocamada de células OP9-DL1. No dia oito, pipete suavemente para baixo as células fracamente aderidas, centrifugue as células e, em seguida, transfira-as para um único poço de uma placa de cultura de seis poços revestida com células OP9-DL1 confluente. Incube as células a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, por mais duas semanas. No dia 22.

Incube as células IPS destacadas em meio fresco em uma nova placa de cultura a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, remova cerca de metade das células em suspensão e passe-as por uma peneira de náilon de 70 mícrons para excluir agregados celulares e lave a suspensão resultante de células isoladas três vezes com PBS frio. Após a terceira lavagem, re-suspenda as células em PBS a 1,5 vezes 10 elevado à sétima células por mililitro e mantenha as células em gelo antes da injeção IV.

Coloque um camundongo deficiente em rag com quatro semanas de idade sob uma luz infravermelha para dilatar a veia da cauda. Em seguida, encha uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de 26 e meia polegadas com 200 microlitros da suspensão celular e transfira adotivamente as células através da veia da cauda dilatada. Três semanas depois, após confirmar a eutanásia do camundongo que recebeu a transferência adotiva, remova os linfonodos e o baço após a desagregação mecânica dos tecidos.

Lise a suspensão de células isoladas com um tampão de lise CK e, em seguida, lave os mononucleócitos resultantes duas vezes em PBS frio. Após a coloração para marcadores de superfície celular, avalie as células por análise citométrica de fluxo no dia zero; no dia um, utilize o reagente de transfeção JAMA para transfectar células empacotadoras platE previamente semeadas durante a noite com um OT one MIDR; no dia dois, semeie um vezes 10 à sexta potência de células IPS em um poço de uma placa de 24 poços pré-revestida com gelatina a 0,1%, colete o pseudovírus contendo S natin das células platE e, em seguida, filtre-o através de um filtro de 0,4 mícron para excluir possíveis contaminantes após a centrifugação. Transduza as células na presença de polibrena por uma hora a 330 vezes G a 32 graus Celsius.

Incube-os durante a noite à mesma temperatura após repetir o procedimento de transdução. No quarto dia, trypsinize os olhos nas células IPS transduzidas e, em seguida, após a centrifugação, ressuspenda as células em meio fresco e semeie-as em células alimentadoras pré-codificadas e irradiadas snl 7 6 7. Assim que as células transduzidas atingirem confluência, selecione as células duplamente positivas para GFP e DS red por citometria de fluxo.

Seis semanas após a transferência adotiva das células IPS, injete 50 microlitros de células EEG sete thoma na cavidade peritoneal do mesmo camundongo no dia 50 do desafio tumoral. Utilize um kit de isolamento de células T CD oito positivas da Mil E Biotech para separar células T CD oito positivas do baço e dos linfonodos do animal que recebeu a transferência adotiva. Misture as células T CD oito positivas isoladas com esplenócitos irradiados de um camundongo C 57 black six J ingênuo numa proporção de um para 10 e estimule a co-cultura com 0,5 micromols por mil de ova durante 40 horas.

Posteriormente, adicione o felden A às células por mais quatro horas. Por fim, avalie as populações celulares por análise citométrica de fluxo após o isolamento de células SP de um camundongo C57BL/6J ingênuo. Divida a suspensão celular em dois grupos.

Rotule o grupo CFSE alto com cinco micromols por mililitro de CFSE e estimule as células com 10 microgramas por mililitro de peptídeo ova por uma hora; rotule o grupo CFSE baixo com 0,5 MICROMOL por mililitro de CFSE e não realize a estimulação. Misture 2,5 vezes 10 à sexta potência das células CFSE alta com 2,5 vezes 10 à sexta potência das células CFSE baixa em PBS. Em seguida, analise as células por citometria de fluxo quanto à expressão de CFSE.

16 horas após a transferência adotiva para o camundongo de interesse, conte as células tumorais intraperitoneais no dia 20 do desafio tumoral. Utilize uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de 18 e meia polegadas e PBS frio para lavar a cavidade peritoneal. Conte as células tumorais recuperadas para identificar as células infiltrantes tumorais.

Remova o tumor em um estágio avançado do desafio tumoral e, em seguida, corte o tumor em três pedaços. Coloque o primeiro pedaço do tumor em um tubo criogênico e posicione o tubo sobre gelo seco. Fixe imediatamente o segundo pedaço em formaldeído.

Preserve o terceiro fragmento em meio RPMI 1640 condicionado após secar ao ar as seções de tecido criopreservadas. Fixe-as em acetona fria por 15 minutos após secar ao ar as seções fixadas por mais 15 minutos. Lave as lâminas por cinco minutos em PBS após a lavagem.

Coloque as lâminas em uma câmara úmida e cubra as seções de tecido com 30 microlitros de 3% B, SA e PBS durante 30 minutos para bloquear a ligação não específica. Em seguida, remova o tampão de bloqueio por aspiração e incube as seções de tecido com uma mistura de 50 microlitros de anticorpo pe anti-TCR RV alfa dois e anticorpo fitzy anti-ova, diluídos em 3% PSA em PBS, na câmara úmida por duas horas. Ao final da incubação, lave as lâminas três vezes em PBS frio e, por fim, monte as seções com um meio de montagem à base de água antes da análise por microscopia fluorescente para exame citométrico de fluxo de linfócitos T infiltrantes no tumor.

Esmague o tumor para obter uma suspensão de células únicas. Em seguida, analise as células quanto a marcadores superficiais específicos. C CD três e TCR beta são utilizados como marcadores de células T para determinar se a estimulação de células IPS com o ligante Notch DL um poderia contribuir para a expressão na superfície celular de CD quatro e CD oito em células derivadas de células IPS positivas para CD três e TCR beta positivas.

Observe o gráfico de dispersão à direita, que mostra células T positivas para CD3, positivas para TCRβ, negativas para CD4 e positivas para CD8, geradas a partir de células IPS in vitro no dia 22. Além disso, as células únicas positivas derivadas de células IPS da figura anterior produziram interleucina-2 e interferon gama quando estimuladas in vitro por anticorpos anti-CD3 revestidos em placa e anticorpos anti-CD28 solúveis, confirmando que as células T derivadas de células IPS são funcionais após transferência adotiva em camundongos receptores. A maioria das células IPS transduzidas com o gene do TCR sofreu diferenciação em linfócitos T citotóxicos positivos para CD8, que responderam in vitro à estimulação com peptídeos por meio da secreção de interleucina-2 e interferon gama nestes gráficos de dispersão obtidos de células linfonodais e esplênicas agrupadas.

Células T CD8 positivas Vβ5 positivas foram geradas em camundongos que receberam células IPS transduzidas com TCR, mas não em camundongos que receberam células IPS transduzidas controle. As populações CD8 positivas Vβ5 positivas foram positivas para coloração intracelular de citocinas, demonstrando produção de interleucina-2 e interferon-gama, representadas nestes histogramas pelas linhas escuras, em comparação com os histogramas de controle de isotipo sombreados, indicando que os CTLs derivados de IPS eram funcionais. Esses dados mostram que células CFSE altas pulsadas com epítopo, representadas pelos picos à direita em cada gráfico, e células controle CFSE baixas, representadas pelos picos à esquerda, foram injetadas em camundongos 10 semanas após a transferência de células IPS ou um dia após a transferência de CTLs OVA-específicos.

Os CTLs derivados de IPS específicos para o antígeno responderam à estimulação com antígeno e apresentaram atividade citotóxica, conforme indicado pela ausência de células CFSE altas aqui. Células IPS transduzidas com o gene do TCR OT-I foram transferidas adotivamente para camundongos C57BL/6 e, em seguida, os animais foram desafiados com células tumorais OVA7 na vigésima-feira; as células tumorais na cavidade peritoneal foram enumeradas. Observe a redução significativa no número de células tumorais em camundongos que receberam IPS transduzidas com TCR em comparação com os grupos-controle.

Acima de tudo, a transferência adotiva de células IPS TRANSDUZIDAS com TCR induziu a infiltração de CTLs hiperreativos nos tecidos tumorais e protegeu os animais do desafio tumoral, conforme observado nesta coloração de h e e de tecidos tumorais recuperados entre os dias 30 e 35 após o desafio tumoral, provenientes de camundongos que receberam transferência adotiva de células transduzidas com TCR ou CTLs OT um, mas não de animais injetados com controle simulado ou controle. As células transduzidas foram infiltradas por células inflamatórias, conforme indicado pelas setas vermelhas aqui. CTLs V alfa dois positivos específicos para ova, em vermelho, foram encontrados infiltrando tecidos tumorais que expressam ova, em verde.

Embora os tumores em camundongos dos grupos controle tivessem poucas ou nenhuma célula infiltrante tumoral nesta figura, suspensões de células individuais provenientes de tecidos tumorais foram analisadas quanto à expressão da positividade para V alfa dois e positividade para V beta cinco por citometria de fluxo após seleção da população positiva para CD oito. Observe que os tecidos tumorais de camundongos que receberam transferência adotiva de células IPS transduzidas com TCR exibiram o maior nível de células infiltrantes tumorais, enquanto os tumores de camundongos que receberam IPS transduzidas controle não apresentaram infiltração por linfócitos T positivos para CD oito e específicos para ova.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar linfócitos T específicos para antígenos a partir de células IPS e como avaliar as funções dos linfócitos T derivados de IPS.