Imobilização planária, irradiação parcial e Transplante de Tecidos

O objetivo geral do experimento a seguir é posicionar uma população de células-tronco saudáveis adjacentes a um tecido com células-tronco ablatadas dentro de um pariano, a fim de analisar os comportamentos das células-tronco e de suas células-filhas in vivo durante a regeneração. Isso é conseguido anestesiando e imobilizando um pariano não irradiado ou previamente irradiado por Leafly para manipulações posteriores. Em seguida, o pariano imobilizado não irradiado é parcialmente protegido com chumbo e então submetido à irradiação com raios X, o que produz um pariano não lesionado com tecido de células-tronco ablatadas adjacente ao tecido protegido, que permanece rico em células-tronco.

Alternativamente, um enxerto de tecido obtido de um doador não irradiado pode ser transplantado para um hospedeiro previamente irradiado, a fim de produzir um parabionte com uma população isolada de células-tronco, ainda presentes dentro de um hospedeiro cujas células-tronco foram ablatadas. Os resultados obtidos mostram populações isoladas de células-tronco adjacentes aos tecidos com ablação de células-tronco, mediante hibridização in situ de RNA em preparação inteira para genes marcadores de células-tronco.

Assim, os métodos descritos aqui visam compreender melhor a regeneração em planárias ao estudar o comportamento das células-tronco em dois paradigmas: transplante e irradiação parcial, o que nos permite testar se os tecidos circundantes e os ambientes locais nos quais essas células-tronco residem afetam ou não o comportamento dessas neoblastos ou células-tronco. Durante o processo de regeneração, de um a dois meses antes do experimento, alimente as plin de acordo com o manuscrito anexo. Para obter o tamanho desejado nesta demonstração, selecione plin com comprimento entre um e dois centímetros e largura superior a dois milímetros.

Em seguida, eles são mantidos em jejum por três a sete dias antes do uso. A seguir, prepare a solução de clorotona, um anestésico local suave, dissolvendo 0,1 a 0,2% peso por volume de cleona em água pariana. Em seguida, resfrie a solução em gelo para transplante de tecido com um bico de Bunsen, dobre um tubo capilar com diâmetro interno de 0,75 milímetro a um ou dois centímetros da extremidade em um ângulo de 90 graus para cortar o tecido enxerto.

Em seguida, dobre outro tubo capilar com diâmetro externo de 0,7 milímetro a uma ou dois centímetros da extremidade em um ângulo de 90 graus para criar um orifício no hospedeiro que receberá o enxerto. Depois, corte o papel filtro preto Watman. Papel filtro Kimwipe e papel de enrolar cigarros conforme os tamanhos indicados no manuscrito anexo.

Em seguida, prepare a solução modificada de Holt Fers e a solução saturada de Caine de Holt Fretter. Resfrie ambas a quatro graus Celsius. Depois, fixe uma toalha de papel Kim a um quadrado de Paraform.

Coloque-o sobre a placa do refrigerador Peltier ou outro dispositivo de resfriamento sob um microscópio estereoscópico. Em seguida, saturar o lenço de papel Kim com solução Holt Fretter gelada. Depois, coloque dois retângulos de papel filtro preto sobre o lenço de papel Kim.

Agora coloque um pedaço de papel-filtro Watman número dois em uma placa de Petri. Umedeça o papel-filtro com solução de Holt Fretter. Em seguida, resfrie a placa em gelo para irradiação parcial.

Coloque um forro de papel maior em um recipiente maior, de forma semelhante ao transplante de tecidos. Umedeça o papel filtro com solução Holt Fretter. Em seguida, resfrie o recipiente em gelo.

Neste procedimento, preencha uma placa de Petri com solução de cleona gelada. Pipete a Planaria para dentro da placa para transplante. Anestesie apenas um hospedeiro e um doador por vez.

Para irradiação parcial, muitos animais podem ser anestesiados ao mesmo tempo. Em seguida, deixe os paria mergulhados na solução de cleona por cinco a dez minutos, até que fiquem imóveis. Lave os paria pipetando-os para uma placa contendo solução de Holt Fretter gelada.

Em seguida, imobilize a área de plín pipetando-as sobre papéis-filtro pretos saturados com solução de Holt fretter gelada. Então, posicione-as com a face ventral voltada para baixo usando um par de pinças. Agora, coloque uma placa de Petri gelada, preparada anteriormente, dentro de um recipiente com gelo que caiba dentro de um irradiador de raios X de fonte superior.

Organize a área plin anestesiada em uma placa de Petri movendo os papéis de filtro pretos. Em seguida, transfira-os para a fonte superior do irradiador de raios X, posicionando o balde de gelo de modo que a distância entre o tubo catódico e a paria seja minimizada. Assim, maximizando a taxa de dose efetiva.

Em seguida, posicione os escudos de chumbo entre o paria e o tubo catódico para a dose de raio-x. Se for desejada a ablação completa das células-tronco provenientes de regiões não protegidas, aplique 30 grays ou mais. Imediatamente após a emissão de raio-x, transfira o paria para água de paria resfriada.

Em seguida, deixe a água pariana aquecer até a temperatura ambiente e os animais se soltarem do papel filtro preto. O procedimento de irradiação parcial está agora concluído. Para iniciar este procedimento sob o microscópio estereoscópico, posicione o hospedeiro e o doador anestesiados na plin área sobre filtros pretos retangulares separados sobre a toalha de papel Kim, que já foi resfriada na placa peltier ou placa refrigeradora.

Use um tubo capilar com diâmetro interno de 0,75 milímetro para recortar o fragmento do enxerto a partir do doador. Em seguida, use um par de pinças para posicioná-lo em uma região afastada do hospedeiro. Depois, use um tubo capilar com diâmetro externo de 0,7 milímetro para remover um fragmento do hospedeiro.

Posicione subsequentemente o enxerto no orifício. Transfira o hospedeiro transplantado sobre o papel filtro preto retangular para a placa de Petri preparada anteriormente. Umedeça um pedaço de papel de rolo com solução saturada de Caine-Holt Fretter.

Em seguida, coloque-o sobre o hospedeiro transplantado. Depois, umedeça quatro pedaços de papel-filtro contendo solução saturada de Holter e, caso o hospedeiro transplantado afunde, umedeça quatro maços de pedaços de lenço Kim contendo solução saturada de Holt Fretter. Coloque-os sobre os papéis-filtro.

Depois disso, feche a tampa. Coloque a placa de Petri sobre gelo. Em seguida, transfira o parênquima doador para a água de parênquima para recuperação e regeneração.

Quando todos os transplantes forem concluídos, coloque o parian transplantado em uma incubadora a 10 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, transfira-o para uma placa de Petri contendo água de parian. Deixe o parian soltar-se espontaneamente do papel filtro ou remova-o suavemente com pinça e troque a água de parian uma vez a cada dois ou três dias a partir de então.

A hibridização in situ com sonda de montagem mostra uma distribuição de células-tronco indistinguível daquela do parian selvagem no parian fixado três dias após a irradiação, que foi irradiado, mas totalmente protegido como controle. Por outro lado, no parian que foi apenas parcialmente protegido, deixando as regiões anterior e posterior expostas, as células-tronco parecem ter sido ablatadas nas regiões não protegidas. Aqui são mostradas as vistas dorsal e ventral de um parian transplantado com sucesso.

Três dias após o transplante, o enxerto é claramente visível em ambas as superfícies dorsal e ventral e está cercado por tecido despigmentado característico na interface entre o enxerto e o hospedeiro. No entanto, o transplante malsucedido não exibe tecido enxertado visível no local do transplante. A hibridização in situ em montagem inteira revelou a presença de células-tronco apenas no local do enxerto ou ao redor dele, o que indica o sucesso do transplante uma vez dominado.

Os transplantes podem ser realizados em apenas cinco minutos cada. Com taxas de sucesso próximas de 90 a 100%, e com irradiação parcial, o procedimento pode ser ampliado significativamente, assumindo que o tamanho do campo do seu irradiador seja suficientemente grande.