Preparando-se Fator de Crescimento de Células T esplenócitos Rat

Olá, sou Christine Beaton. Sou pesquisadora assistente no laboratório de George Chen, do Departamento de Fisiologia e Biofísica da Universidade da Califórnia em Irvine. E, nos próximos dois dias, vou mostrar a vocês como preparar o TCGF, que significa fator de crescimento de células T.

Portanto, para a nossa cultura celular de rotina, quando não precisamos de um conhecimento preciso da composição das citocinas no meio de cultura, utilizamos o fator de crescimento de células T, que é um sobrenadante S proveniente de cultura de baço de camundongos CY, o qual contém as citocinas necessárias para auxiliar a expansão das células T. Assim, preparamos o FCT da seguinte maneira: sacrificamos ratos Louis saudáveis, retiramos seus baços, preparamos uma suspensão de células únicas, eliminamos os glóbulos vermelhos por lise e, em seguida, estimulamos as células mononucleares com concanavalina A, o que induzirá as células T a produzirem todas as citocinas necessárias para seu crescimento. Para gerar o FCT, precisamos ativar as células.

Então, o modo como fazemos é adicionar lectina conval, abreviada como corona A, ao nosso cultivo celular. Quando adicionamos a conc em a ao nosso cultivo celular, ela irá se ligar ao complexo do receptor de células T glicosilado e, ao se ligar a vários desses complexos simultaneamente, irá promover o que chamamos de capping. Assim, irá agregar, formando um agrupamento de todos os receptores na superfície da célula, o que induzirá um sinal de ativação nos linfócitos T.

Assim, após as células terem sido ativadas, elas irão sofrer blastogênese. Ou seja, irão aumentar de tamanho e, em seguida, começar a secretar citocinas. Inicialmente, pensávamos que o FCT era principalmente a interleucina dois, mas agora sabemos que esse não é realmente o caso.

Ele também contém interferon gama, TNF alfa e provavelmente outras citocinas em quantidades muito pequenas, suficientes apenas para manter as células vivas após 48 horas. Em cultura, as células produziram todas as citocinas de que precisamos. Portanto, vamos remover as células e, quando tivermos removido as células e restar apenas o sobrenadante, ainda teremos alguma conal livre no sobrenadante. E isso será um problema, porque queremos realmente usar nosso fator de crescimento de linfócitos T para manter as linhagens de células T em crescimento.

E se deixarmos a conval livre ali, ela vai ativar as células quando não quisermos que sejam ativadas. Para contornar esse problema, vamos adicionar um excesso de um açúcar que irá ligar-se a toda a conval livre, no meio. Assim, ela ficará completamente inativada e não se ligará a outros receptores glicosilados nas células quando adicionarmos o TCGF à cultura.

Então vamos começar. O primeiro passo para este experimento é remover os baços de ratos imediatamente após a eutanásia. É exatamente isso que vou fazer agora, utilizando instrumentos estéreis.

E uma vez que eu retirar os baços, vou colocá-los em PBS suplementado com antibióticos, e como antibióticos utilizo penicilina e estreptomicina. Vamos começar. Então, eu borrifo o rato com etanol a 70% para garantir que não haja qualquer contaminação da minha cultura.

Em seguida, usando meus instrumentos, vou fazer um pequeno corte na pele aqui. Depois, removo uma camada de músculo e o baço aparece bem aqui. Então, pego outra pinça e retiro suavemente o baço sem danificá-lo.

Removo o tecido conjuntivo assim. Agora tenho um baço. É claro que tenho muito cuidado para não danificar nada dentro da cavidade abdominal, pois qualquer dano ao intestino causará contaminação imediata do meu baço.

Em seguida, vou transferir meu baço para um tubo contendo PBS com antibióticos. Mantenho esse tubo sobre gelo. Agora, coletei os baços de três ratos.

Então estamos prontos para começar e preparar uma suspensão de células isoladas a partir desses baços. Agora que tenho meus baços, os trouxe para uma câmara de cultura celular para preparar uma suspensão de células únicas a partir deles usando peneiras celulares de 70 mícrons. Portanto, precisarei de várias coisas para fazer a suspensão de células únicas a partir dos baços.

Preciso de instrumentos estéreis, um par de pinças e um par de tesouras. Em seguida, coloco o êmbolo de uma seringa estéril de um mililitro na placa de Petri. Vou colocar meus baços em PBS com antibióticos.

E em outro recipiente de Petri, coloquei uma peneira de células de 70 mícrons em 10 mililitros de PBS com antibióticos. Portanto, o primeiro passo é garantir que os baços estejam limpos, pois, como é possível observar aqui, ainda há pequenos pedaços de tecido conjuntivo, e vou removê-los porque eles entopem rapidamente a peneira de células. Para isso, simplesmente corto o que não quero e descarto na tampa do recipiente de Petri.

Agora meus baços estão principalmente limpos, então vou pegar os baços um por um, colocá-los no coletor celular e cortá-los em pequenos pedaços. Em seguida, misturo os três baços. O próximo passo é obter uma suspensão simples de células. É claro que, como quero manter tudo estéril, não toco em hipótese alguma no coletor celular e uso o êmbolo de uma seringa estéril de um mililitro para pressionar meus pedaços de baço através do coletor celular.

E como você pode ver na parte externa do triturador de tecidos, estou preparando uma suspensão de células isoladas. Na primeira vez ainda tenho alguns pequenos fragmentos de baço, mas já vou coletar a suspensão de células isoladas. Já a transfiro para um tubo de 50 ml que mantive em gelo.

E vou reabastecer meu filtro celular com mais 10 mililitros de PBS e antibióticos. Então, pego mais 10 mililitros do meu PBS com antibióticos, aproximadamente, não precisa ser exatamente 10 minutos, estamos apenas lavando. Coloco no filtro celular e depois uso o mesmo procedimento.

Volto para o êmbolo da minha seringa e pressiono um pouco mais através do ocid. É claro que você nunca conseguirá passar tudo, porque haverá tecido conjuntivo e pequenos fragmentos de gordura que não pude remover e que permanecerão no filtro celular. Mas você deve obter a maior parte do baço no filtro celular.

Em seguida, repito exatamente o que fiz anteriormente. Vou colher a minha suspensão de células isoladas e adicioná-la ao mesmo dente. Neste momento, quase nada da peneira celular permanece no peneirador de células e o PBS que sai está muito mais claro. Vou simplesmente lavar mais uma vez e, a esta altura, deveríamos ter removido a maior parte das células.

Agora tenho minha suspensão de células únicas de PLE citos e vou centrifugá-las simplesmente para paletá-las. Assim, centrifugar por oito a 10 minutos será suficiente. Agora centrifugamos nossos PLE citos e temos uma boa pelota.

O que vou fazer é remover o sobrenatante e, em seguida, lisar as células vermelhas do sangue. Então, vou suspender os miócitos em cloreto de amônio. É uma solução de cloreto de amônio 0,15 molar e vou usar cinco mililitros por baço.

Como tenho três baços, vou usar 15 mililitros de cloreto de amônio e farei isso sobre gelo. Para lisar os eritrócitos, vou pipetar suavemente para cima e para baixo durante três minutos. Ok, usaremos esta imagem com maior exposição aqui.

Agora analisei os eletrócitos durante três minutos. Vou encher meu tubo com PBS, ou você também pode usar meio. Isso serve para restaurar a osmolaridade da solução à faixa normal para as células.

E vou centrifugar as células como fiz anteriormente por oito a 10 minutos para formar o pellet. Em seguida, lavarei as células duas vezes usando o mesmo PBS com antibióticos. Agora centrifugamos as células após a dissociação dos eletrócitos e não se preocupe, nunca obtemos uma liberação de cem por cento dos eletrócitos.

Então, o pellet continuará vermelho, mas o sobrenatante ficará mais claro. Agora vou esvaziar o sobrenatante, ressuspender o pellet, adicionar PBS até 50 ml, centrifugar e repetir esse passo mais uma vez, de modo que tenha dois lavagens. Depois disso, poderei realizar a contagem. Lavei meus miócitos duas vezes e, em seguida, os suspender em meio de cultura e os contei utilizando o citômetro.

Como esperado. De três baços obtive cerca de 600 milhões de células, o que é esperado, já que um baço normalmente nos fornece de 200 a 250 milhões de células. Então, o que vou fazer agora é semear minhas células a 2 milhões por mililitro no meu meio que foi suplementado com 10% de soro de bezerro fetal.

E a esse meio, vou adicionar dois microgramas por mililitro de conc A para estimular as células. E depois disso, simplesmente vou colocar as células no incubador por 48 horas. As células agora estiveram no incubador por 48 horas e, como vou mostrar, cresceram bastante bem.

O meio ficou laranja. Portanto, agora estamos prontos para finalizar nossa preparação para o TCGF. Como você se lembra, adicionei con canavalina na minha suspensão celular para ativar as células.

Então, a concanavalina A é uma lectina. Ela irá ligar-se aos açúcares em todos os receptores da célula T e irá ativar artificialmente todas essas células. O problema que temos agora é que ainda temos parte da concanavalina A no sobrenadante celular.

E como vamos usar uma snat em outros cultivos de células T para expandir as células, não queremos que a con carnaval esteja presente nesses cultivos celulares. Então, para nos livrarmos dela, o que vou fazer é adicionar um excesso de açúcar ao qual a con naval se liga, e esse açúcar é a metil alfa D citose mostrada aqui. E vou adicionar um excesso desse açúcar, dissolvendo-o completamente.

Ele irá ligar-se a toda a concentração remanescente de conc naval em A. Uma vez concluído isso, vou filtrar esterilmente os sobrenadantes celulares e congelar alíquotas para uso nas próximas semanas ou meses. Vamos, então, começar esta última etapa. Estou adicionando o sobrenadante de cultura celular a tubos de 50 ml para poder centrifugá-los e remover as células.

Então, simplesmente preencho quantos tubos forem necessários e não faço isso na câmara de cultura; eu poderia fazer, mas como preciso filtrar a minha solução no final de qualquer forma, porque estou adicionando o açúcar, que não é estéril, simplesmente faço isso na bancada. É mais fácil. Agora despejei todas as minhas células e sobrenadante nos meus tubos cónicos de 50 ml.

Então, vou levá-los para a centrífuga e centrifugar por cerca de 10 minutos. O único motivo para centrifugar é pelotizar as células, de modo que eu tenha sobrenadantes claros. As células foram agora sedimentadas, então o sobrenadante está claro e é isso que eu desejava coletar.

Então, vou coletar todo o sobrenatante em um frasco limpo de 150 centímetros quadrados. E a este frasco vou adicionar o açúcar. Enquanto as células estavam sendo centrifugadas, pesei açúcar suficiente para adicionar 15 miligramas por ml de sobrenatante.

Vou deixar completamente, deixar que dissolva, e depois vou filtrar esterilmente o meu sobrenatante. Agora vou adicionar o açúcar: 15 miligramas por ml de sobrenatante. Coloco a tampa de volta e, como não estou trabalhando em condições estéreis, não importa se entra ar na tampa; portanto, misturo até que todo o açúcar esteja dissolvido.

Isso deve ser bem rápido. Sim, todo o açúcar já está dissolvido agora. Então, tudo o que preciso fazer é filtrar esterilmente o sobrenadante e, em seguida, vou fracioná-lo.

Normalmente, faço alíquotas de 10 a 15 ml que armazeno a menos 20 graus. Alíquotas como essas podem ser armazenadas por vários meses. Você também pode armazenar seu TCGF na geladeira, mas nesse caso eu o utilizaria nos próximos 10 a 15 dias.

Nos últimos dois dias, mostrei como preparar o fator de crescimento de linfócitos T, e esse sobrenadante é muito simples de produzir e muito barato de preparar. Por isso, usamos com frequência no laboratório para manter nossas linhagens de linfócitos T em cultura, sem precisar comprar coquetéis caros de citocinas. Boa sorte em seus experimentos.