Purificação por afinidade de Complexos de Influenza Virus ribonucleoproteína da cromatina de células infectadas

Vírus de RNA de fita negativa Lyco. O genoma dos vírus da influenza é empacotado na forma de complexos de ribonucleoproteína viral, ou VR nps, nos quais o genoma de fita simples é encapsulado pela proteína nuclear e associado ao complexo da polimerase de cúrcuma, composto pelas subunidades PA, PB um e PB dois, para purificar complexos intactos a partir de células de mamíferos infectadas. Células HeLa são incubadas com vírus da influenza recombinante marcado com strept.

Uma vez que o vírus entra nas células, o RNA viral é sintetizado nos núcleos após a infecção. As células são lisadas utilizando um detergente e fracionadas em frações citoplasmática, nuclear e de cromatina por meio de centrifugação e um protocolo de fracionamento de cromatina baseado em detergentes. Por fim, os VRPs marcados com strept são purificados por afinidade a partir de cada fração. A análise da composição proteica e de RNA dos VRPs purificados por meio de coloração com prata demonstra que, utilizando este protocolo, é possível isolar mesmo os VRPs fortemente ligados à cromatina de forma intacta. Assim, uma das principais vantagens do nosso protocolo, em comparação com métodos convencionais de purificação por afinidade de complexos ribonucleoproteicos do vírus influenza, é que, com o nosso método, é possível purificar os VRPs a partir da cromatina de células infectadas, local conhecido como sítio de síntese do mRNA do vírus influenza.

Portanto, nosso método pode ser utilizado para responder perguntas sobre a regulação da replicação e transcrição virais, como, por exemplo, quais fatores virais ou celulares, bem como quais modificações pós-traducionais são necessárias, por exemplo, para a síntese de mRNA viral ou também para a síntese de RNA genômico viral. Assim, pesquisadores novos neste método podem enfrentar algumas dificuldades, pois a fracionamento subnuclear é muito sensível às condições bioquímicas e também pode variar bastante entre diferentes linhagens celulares. Inicie este protocolo com células saudáveis que foram infectadas com o vírus da influenza RWSN PB dois strep, que possui uma etiqueta strep fundida geneticamente à extremidade C do subunidade PB dois, com uma multiplicidade de infecção de três.

Lave as células uma vez com PBS frio, depois adicione 12 mililitros de PBS frio e remova-as da placa. Usando uma espátula de borracha, transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros e pelote-as por centrifugação.

O aspecto mais difícil deste procedimento é o protocolo de fracionamento celular. Os núcleos celulares são muito sensíveis aos procedimentos de homogeneização e mistura, e se realizados incorretamente, podem facilmente comprometer um extrato de cromatina. Por isso, é muito importante seguir não apenas as técnicas de homogeneização, mas também o manuseio geral dos lisados, conforme mostramos aqui.

Após a centrifugação e remoção do sobrenadante, suspenda o pellet celular em 10 mililitros de tampão de sacarose frio. Fixe uma ponteira de pipeta de 200 microlitros a uma pipeta de soro plástica de 10 mililitros e passe as células através dela para dissociar os agregados celulares. Incube a suspensão em gelo durante 10 minutos.

Inverta periodicamente as células suavemente para ressuspender. Em seguida, adicione Non IET P 40 até uma concentração final de 0,5% e vortexie em alta velocidade por 15 segundos; imediatamente, centrifugue por 10 minutos a 3.500 ×g a quatro graus Celsius em uma centrífuga de bancada. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e transfira-o para um tubo cônico de 15 mililitros.

Armazene o sobrenadante a quatro graus Celsius. Esta é uma fração citoplasmática. O pellet deve ser menor e mais branco do que o pellet celular original, conforme mostrado aqui.

Se o protocolo for concluído em um momento posterior, armazene o pellet celular a quatro graus Celsius. Caso contrário, prossiga lavando o pellet em cinco mililitros de tampão de sacarose frio e centrifugando como antes. Após a conclusão da centrifugação, descarte o sobrenadante e reconstitua o pellet, que contém os núcleos, em 1,5 mililitro de tampão de extração nuclear frio.

Transfira o pellet re-suspenso para um homogeneizador de vidro de quatro mililitros gelado com pistilo de encaixe justo e homogeneíze os núcleos com 20 golpes. Evitando a formação de espuma, a resistência deve aumentar após aproximadamente 10 golpes. Para confirmar uma homogeneização eficiente, examine a amostra em um microscópio de contraste de fase.

Os núcleos não devem mais ser redondos, mas apresentar formas irregulares e parecer que estouraram. Uma vez que os núcleos tenham sido homogeneizados, transfira-os para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Incube o homogeneizado em rotação na roda giratória a quatro graus Celsius por 20 minutos.

Em seguida, centrifugue a 16.000 × g em uma centrífuga micro para 10 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, transfira o sobrenadante, que é a fração nucleoplasmática, para um tubo de 1,5 mililitro e armazene-o a quatro graus Celsius. Em seguida, ressuspenda o precipitado em 1,5 mililitros de tampão de digestão pré-aquecido a 37 graus Celsius.

Em seguida, incubar a fração por 10 minutos a 37 graus Celsius. Depois, adicionar 42 microlitros de cloreto de sódio cinco molar para atingir uma concentração final de cloreto de sódio de 150 milimolar e, então, incubar por 20 minutos em gelo. Centrifugar a 16.000 × g em uma microcentrífuga a quatro graus Celsius por 10 minutos.

Após centrifugar, remova o sobrenadante e armazene a 4 graus Celsius. Esta é a fração CH um 50. Re-suspenda o pellet em 1,5 mililitros de tampão de alta salinidade frio e incube por 20 minutos no gelo.

Centrifugue a 16.000 × g em uma microcentrífuga a quatro graus Celsius por 10 minutos. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e armazene-o a quatro graus Celsius. Esta é a fração CH 500.

Retire as frações salvas durante o protocolo de fracionamento e coloque-as no gelo. Em seguida, adicione 300 microlitros de cloreto de sódio cinco molar à fração citoplasmática. Depois, transfira 100 microlitros de strep T ligado em microesferas Sphero por fração para um tubo cônico de 15 mililitros.

Adicione 10 volumes do tampão de lavagem com estreptavidina às esferas. Inverta o tubo para misturar e centrifugue por cinco minutos a 1000 vezes G em uma centrífuga de bancada; descarte o sobrenadante.

Repita a lavagem com o tampão duas vezes e, em seguida, ressuspenda o pellet em volume igual de tampão de lavagem com strep. Adicione 200 microlitros de streptavidina ligada a perlas em suspensão lavada a cada fração. Incube as tubos sob rotação durante uma hora a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugue os tubos durante um minuto a 1000 ×g e quatro graus Celsius, e descarte o sobrenadante.

Em seguida, adicione um mililitro de tampão de lavagem às esferas que foram incubadas com a fração citoplasmática em um tubo de 15 mililitros. Adicione o tampão de lavagem e transfira as esferas para um tubo de 1,5 mililitro. Lave as esferas por um minuto, depois centrifugue os tubos por um minuto a 1000 × g a quatro graus Celsius.

Repita duas vezes após a última etapa de lavagem. Remova todos os vestígios do tampão de lavagem utilizando uma ponta de pipeta plana. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de eluição e misture suavemente, colocando os tubos no gelo por 15 minutos.

Durante a incubação, misture ocasionalmente as esferas batendo suavemente na base dos tubos. Após 15 minutos, centrifugue por um minuto a 1000 × g a quatro graus Celsius. Colete a fração sobrenadante contendo os VRPs eluídos com marcação Strep.

Ele, nossas células foram infectadas com a cepa do vírus da gripe WSN por nove horas, e os lisados fracionados foram analisados por western blot, conforme mostrado aqui. O isolamento suave de núcleos extrai eficientemente proteínas citoplasmáticas, como a tubulina, ao mesmo tempo que evita a liberação de proteínas nucleares abundantes. Observe que a fração de cromatina extraída com sal baixo é enriquecida em proteínas importantes para a transcrição.

Embora a fração de alta salinidade contenha principalmente nucleossomos, para determinar a composição proteica da fração citoplasmática eluída, V NPS de células he R infectadas por nove horas com vírus não marcado, RWSN ou RWSN PB dois strep foram analisados por coloração com prata, conforme mostrado para um eluato citoplasmático. Aqui há uma alta proporção de NP em relação a PA PB um, PB dois, evidenciada pela principal banda acima de 55 quilodaltons em comparação com as bandas entre 95 e 100 quilodaltons, sugerindo que a maior parte do PB dois strep é purificada como parte de um VRNP completamente formado, ou em outras palavras, pouca polimerase solúvel é capturada para comparar rendimentos relativos. VR NPS podem ser purificados a partir de todas as quatro frações celulares após nove horas de infecção e foram purificados após nove horas de infecção com RWSN PB dois strep ou RWSN e corados com prata, conforme mostrado neste gel de coloração com prata.

A maior concentração de vRNP encontra-se no nucleoplasma, embora grandes quantidades também possam ser purificadas a partir do citoplasma e da cromatina. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como purificar altos rendimentos de complexos de ribonucleoproteína de vírus da gripe intactos a partir do núcleo de células infectadas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de usar tampões limpos e evitar expor desnecessariamente as amostras à temperatura ambiente, pois dessa forma é possível evitar tanto a degradação de RNA e proteínas quanto a desmontagem dos complexos proteicos.

E não se esqueça de que trabalhar com um vírus da gripe infeccioso pode ser perigoso. Todas as etapas devem ser realizadas em uma bancada de nível de biossegurança dois até que o NP 40 tenha sido adicionado aos lisados.