Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

O objetivo geral deste procedimento é isolar células endoteliais humanas de alta qualidade e utilizá-las para examinar os mecanismos que regulam a transmigração de neutrófilos sob condições de fluxo. Isso é realizado primeiramente isolando e semeando células endoteliais de veia umbilical humana. O segundo passo consiste em dividir as células em câmaras IBD.

A seguir, neutrófilos humanos recém-isolados são perfundidos sobre células endoteliais ativadas, resultando em rolamento de neutrófilos, adesão firme e transmigração. O passo final consiste em quantificar a transmigração utilizando microscopia de vídeo. Em última análise, microscopia fluorescente e de campo claro podem ser usadas para avaliar a transmigração de neutrófilos através de células endoteliais ativadas.

O isolamento de células endoteliais é fácil de descrever, mas difícil de aprender em parte porque etapas essenciais exigem a visualização do cordão umbilical. Por esse motivo, a demonstração visual deste método é fundamental. Este método nos ajudará a compreender questões centrais na área de inflamação, como o recrutamento de leucócitos sob condições de fluxo, e o comportamento de células endoteliais sob condições de fluxo será melhor compreendido.

Embora este método possa fornecer informações sobre o recrutamento de neutrófilos durante a inflamação, ele também pode ser aplicado a populações raras de leucócitos, como células natural killer e eosinófilos. Demonstrando este procedimento juntamente com Ritu Sharma está Hong Jang, um técnico no meu laboratório. Pelo menos uma hora antes do procedimento, pré-coat e então incubar um frasco T 75 com gelatina a 37 graus Celsius.

Em seguida, inicie o procedimento de isolamento de células endoteliais na cabine de fluxo laminar utilizando um par de tesouras para cortar um cordão umbilical da placenta. Após trocar para luvas estéreis, examine cuidadosamente o cordão e descarte quaisquer porções que contenham coágulos sanguíneos ou apresentem danos causados pela pinça no cordão durante o parto. Em seguida, identifique as duas artérias e a veia única presentes no cordão.

Em seguida, insira suavemente uma cânula com uma torneira de dois sentidos acoplada em uma das extremidades da veia e, então, coloque um grampo ao redor da cânula para fixá-la firmemente em posição. Uma das partes mais difíceis do procedimento é a perfusão do cordão umbilical. Para garantir que isso seja feito com sucesso, perfunda o cordão com tampão em excesso e observe o fluxo até que fique límpido.

Perfunda a veia com tampão de cordão até que o fluxo saia claro e, em seguida, prenda a extremidade do cordão. Ocasionalmente, durante a perfusão, um pequeno orifício é revelado porque os médicos retiraram sangue do cordão umbilical. Nessas situações, hemostatos podem ser usados para bloquear o orifício e a perfusão pode continuar durante o isolamento de células endoteliais.

É criticamente importante cronometrar com precisão o tratamento com colagenase. Um tempo insuficiente resultará na coleta de poucas células endoteliais; um tempo excessivo pode levar à contaminação por células musculares lisas ou a danos nas células endoteliais. Em seguida, perfundir a veia com colagenase recém-preparada e aquecida.

Feche a torneira de fechamento e incube o cordão em um béquer contendo tampão morno para cordão. Após 10 minutos, remova-o e, em seguida, massageie suavemente o cordão para soltar as células endoteliais do lúmen da veia. Drene a solução em um tubo contendo cinco mililitros de meio para células endoteliais ou meio ECM, lavando o cordão com tampão para cordão duas vezes para remover quaisquer células remanescentes.

Em seguida, centrifugue as células por 10 minutos a 350 × g em temperatura ambiente, remova o sobrenadante e, então, re-suspenda o pellet em 10 mililitros de meio para células endoteliais. Transfira as células para um frasco T75 revestido com gelatina e cultive as células endoteliais durante a noite a 37 °C e 5% CO₂. No dia seguinte, agite suavemente o frasco para desprender quaisquer hemácias.

Em seguida, remova o sobrenadante e lave a cultura de células endoteliais com HBSS morno. Após a remoção do HBSS, alimente as células com 10 mililitros de ECM morno. Então, examine as células ao microscópio para garantir que os glóbulos vermelhos foram removidos e para avaliar o grau de confluência e a morfologia das células endoteliais.

Continue a trocar o meio a cada três dias até que as células atinjam confluência. Nesse momento, divida as células utilizando uma solução de tripsina e EDTA. Em seguida, colete as células destacadas e re-suspenda-as em ECM.

Por fim, recubra cada poço de uma câmara IBD com gelatina. Remova a gelatina em excesso e, em seguida, adicione 1,5 vezes 10 à sexta por mililitro da suspensão de células endoteliais em cada poço da câmara. Comece induzindo a superexpressão da expressão na superfície celular de moléculas de adesão e ativação incubando as células endoteliais com um estimulante apropriado enquanto as células endoteliais estão sendo ativadas.

Isoleucione neutrófilos do sangue periférico de voluntários humanos saudáveis por centrifugação em gradiente de densidade conforme publicado anteriormente e, em seguida, suspenda as células em uma concentração de um vezes 10 à sexta por mililitro em HBSS acrescido de albumina humana. Após preparar o microscópio, conecte a câmara IBD contendo as células endoteliais estimuladas à tubulação do microscópio. Selecione a objetiva de contraste de fase 10 x e, então, configure a bomba de seringa para aspirar e iniciar o fluxo de HBSS na tensão de cisalhamento desejada.

Pare brevemente o fluxo girando a válvula de três vias no lado de saída para a posição desligada e trocando a linha de entrada de HBSS para neutrófilos isolados. Reinicie o fluxo girando a válvula de volta para a posição ligada. Em seguida, inicie a gravação usando uma câmera CCD conectada a um gravador de DVD.

Inicie o cronômetro. Quando os neutrófilos entrarem na câmara após quatro minutos, volte ao HBSS para evitar a adesão de novos neutrófilos. Se forem desejados dados sobre interações totais, rolamento e adesão firme, utilize um contraste de fase de 10 x.

Objetivo de imaginar seis campos aleatórios durante 10 segundos cada entre os minutos quatro e cinco. Finalmente, mude para uma objetiva de 40 x e registre um único campo de visão no momento de interesse. Após a perfusão de neutrófilos aos 10 minutos, colete entre cinco e 10 campos de visão aleatórios.

Células endoteliais não estimuladas não suportam o recrutamento de neutrófilos. Portanto, as figuras a seguir mostram neutrófilos interagindo com células endoteliais estimuladas por TNF alfa. Observe o neutrófilo aderente indicado pela seta amarela e o neutrófilo em transmigração indicado pela seta branca.

A transmigração de neutrófilos pode ocorrer nas junções celulares ou através das próprias células endoteliais. Para diferenciar entre essas duas condições, as células endoteliais foram marcadas com um anticorpo anti-VE coerente. Como visto aqui em vermelho, a transmigração é classificada como paracelular ou transcelular.

Neste modelo, praticamente toda a transmigração é paracelular, conforme demonstrado nesta figura que mostra a sobreposição das duas figuras anteriores. No primeiro dos três gráficos, as interações dos neutrófilos foram examinadas e medidas usando o software ImageJ. Observe que ocorreram significativamente mais interações entre neutrófilos e células endoteliais ativadas por TNF alfa do que com as células endoteliais de controle não estimuladas.

As células interagentes totais foram caracterizadas adicionalmente como rolantes, firmemente aderentes ou em transmigração, conforme antes. Ocorreu significativamente mais transmigração de neutrófilos nos poços contendo células endoteliais ativadas após o isolamento das células endoteliais. Os outros métodos, como western blotting, PCR em tempo real e resistência endotelial, podem ser realizados para responder perguntas adicionais relacionadas à biologia das células endoteliais após o desenvolvimento.

Este método ajudará os pesquisadores na área de inflamação e biologia vascular a compreender como ocorre o recrutamento de leucócitos sob condições de fluxo em um sistema modelo humano. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células endoteliais de veia umbilical humana e utilizá-las para estudar a transmigração de neutrófilos sob condições de fluxo usando uma câmara de ity.