Protocolo de Coleta para Pâncreas Humano

O objetivo geral deste procedimento é dissecar o pâncreas humano de maneira que mantenha a orientação anatômica. Isso é realizado removendo o duodeno e o baço do pâncreas e, em seguida, removendo o excesso de gordura e vasos do pâncreas. O segundo passo é pintar a superfície anterior com tinta azul e a superfície posterior com tinta preta.

Em seguida, o pâncreas é dividido em três regiões. Cada região é então fatiada transversalmente em fatias uniformes e colocada em caixas de parafina, moldes de OCT ou picada mais finamente e transferida para tubos. Por fim, amostras são coletadas das três regiões do pâncreas, mantendo-se a orientação anatômica correta para análises futuras.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na pesquisa sobre diabetes tipo um, como os mecanismos subjacentes à perda da massa ou função das células beta e à natureza do ataque das células imunológicas. A demonstração visual do método de processamento do pâncreas é essencial, pois manter a orientação in vivo do pâncreas exige atenção aos detalhes. A demonstração do procedimento será realizada por Linda Snyder, histotecnóloga, e Emily Montgomery, cientista biológica, do meu laboratório.

Inicie preparando todos os materiais necessários para o procedimento. Primeiro, rotule as caixas que conterão os blocos de parafina com um identificador do doador, tipo de amostra, número do alíquota e quaisquer informações adicionais. Em seguida, rotule as formas de OCT da mesma maneira.

Corte pedaços suficientes de folha de alumínio para embrulhar cada bloco de OCT e reserve-os para uso posterior. Prepare todos os frascos necessários para armazenar as amostras frescas e congeladas. Adicione posteriormente RNA e meio RPMI, quando apropriado.

Em seguida, prepare as áreas de trabalho, colocando placas de dissecação, instrumentos esterilizados e todos os outros materiais necessários para o procedimento tanto dentro de uma cabine de segurança biológica quanto sobre uma bancada. Organize todas as cápsulas e moldes de OCT em ordem de utilização, por perto. Prepare um banho de congelamento adicionando isopentano suficiente para cobrir o gelo seco no fundo de uma caixa de isopor.

Para iniciar a dissecação, remova o duodeno e o baço. Comece a separar o duodeno e o pâncreas em uma extremidade e continue até que estejam completamente destacados. O baço está soltamente aderido e pode ser facilmente removido da gordura e do pâncreas.

Em seguida, limpe o pâncreas de vasos adiposos e nervos residuais utilizando uma combinação de dissecação romba e afiada. Reserve a gordura e os linfonodos para serem processados posteriormente. Após a limpeza, coloque o pâncreas sobre uma tábua de dissecação coberta com toalhas de papel.

Manter a orientação correta do pâncreas é o aspecto mais difícil deste procedimento. Para garantir o sucesso, as superfícies anterior e posterior são pintadas com tintas de cores diferentes. Mergulhe um aplicador de algodão na tinta azul, espalhe a tinta sobre a superfície anterior do pâncreas e remova o excesso.

Em seguida, mergulhe um novo aplicador na tinta preta e espalhe-a sobre a superfície posterior do pâncreas. Retorne o pâncreas à sua orientação normal. Com a superfície anterior voltada para cima, o pâncreas está agora pronto para ser cortado em três secções.

Primeiro, corte a junção entre a cabeça e o corpo. Em seguida, divida a porção restante em partes aproximadamente iguais para separar o corpo e a cauda e registre o peso de cada região do pâncreas, começando pela seção da cabeça.

Divida cada região em seções de aproximadamente 0,5 centímetro cortando de maneira transversal, semelhante ao corte de uma barra de pão. Após o corte de cada região do pâncreas, remova a última seção da região da cabeça, que é a seção da junção cabeça-corpo, e coloque-a em uma placa de dissecação separada. Pique esta seção em pedaços pequenos e distribua os pedaços uniformemente entre tubos criogênicos rotulados com e sem RNA.

Posteriormente, os frascos são então congelados. Seguindo procedimentos padrão. Repita este procedimento para a seção da junção do corpo com a cauda.

Uma vez que as amostras picadas tenham sido coletadas, incline todos os cortes transversais para a direita. Cortes alternados de cada região serão removidos. Para blocos de parafina e OCT, remova o primeiro corte para o bloqueio em parafina.

Se uma seção for muito grande, corte-a ao meio. Rotule as cápsulas como A e B. Se o pedaço ainda for muito grande, corte cada seção perpendicularmente ao corte anterior e, em seguida, rotule as cápsulas de A a D no sentido horário. Como visto aqui, posicione a cápsula de modo que o rótulo fique à esquerda.

Em seguida, coloque o tecido na cassete e feche a tampa. Transfira a cassete para um recipiente contendo formalina tamponada neutra. Numere o bloco sequencialmente dentro de cada região, começando pela seção mais medial para blocos de OCT.

Derrame uma fina camada de meio OCT em uma forma previamente rotulada. Antes de introduzir o tecido, cubra-o com meio OCT e congele rapidamente a amostra para uso posterior, retornando então ao tecido que foi reservado anteriormente. Isole os linfonodos pancreáticos removendo a gordura e o tecido conjuntivo ao redor da cápsula do linfonodo. Coloque os linfonodos em uma placa estéril contendo DMEM e pique os linfonodos maiores em pedaços não superiores a 0,5 centímetros.

Uma vez isolados os linfonodos pancreáticos, divida o tecido entre os frascos e as caixas preparadas para processamento adicional. Após finalizar os linfonodos, pique o baço e armazene-o de maneira semelhante. Para processar o duodeno, use uma compressa umedecida para limpar a mucosa de muco, corte a mucosa e, em seguida, seccione-a.

Divida as amostras de mucosa conforme mostrado anteriormente. Usando este procedimento, coletam-se amostras representativas de cada região do pâncreas, como visto aqui. Os pesos das regiões da cabeça, corpo e cauda foram aproximadamente iguais.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como processar um pâncreas humano em diferentes tipos de amostras, especificamente a capacidade de manter a orientação, bem como de como isolar linfonodos da gordura peripancreática.