Isolamento e caracterização de células dendríticas e macrófagos a partir do intestino do rato

O objetivo geral deste procedimento é isolar rapidamente células dendríticas intestinais ou DCs e macrófagos de camundongo para caracterização fenotípica e funcional. Isso é realizado primeiramente colhendo o tecido intestinal. O segundo passo é dissociar o epitélio intestinal da lâmina própria.

Em seguida, a lâmina própria intestinal é digerida nas etapas finais do procedimento. As células da lâmina própria são coradas com fluorescência, anticorpos conjugados e selecionadas para populações celulares específicas. Por fim, as populações de DCs intestinais e macrófagos podem ser caracterizadas e purificadas com maior precisão para estudos funcionais destinados a avaliar a produção de citocinas, a apresentação de antígenos e a regulação de células imunes.

Portanto, a principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que a rapidez da digestão do tecido garante expressão ideal de antígenos na superfície celular, viabilidade celular e ou celularidade. Após eutanasiar o camundongo e confirmar a morte por meio do reflexo de preensão do dedo, aplique um spray de etanol 70% sobre o abdômen e o tórax do animal. Em seguida, utilize uma tesoura para fazer uma pequena incisão horizontal no meio do abdômen e puxe a pele para trás a fim de expor o peritônio.

Abra o peritônio usando tesoura após cortar no esfíncter pilórico para separar o estômago do intestino delgado superior e use pinça para separar o mesentério. Corte novamente na válvula íleo-cecal para liberar todo o intestino delgado do intestino grosso. Continue separando o mesentério do intestino grosso e faça um corte na borda anal.

Use uma tesoura para cortar o cólon longitudinalmente e utilize C-M-F-P-B-S à temperatura ambiente para lavar o conteúdo fecal e o muco da luz intestinal. Em seguida, use a tesoura e a pinça para, macroscopicamente, dissecar as placas de Peyer ao longo da superfície antimesentérica do intestino delgado e corte o intestino delgado aberto longitudinalmente.

Em seguida, limpe o lúmen do intestino delgado de conteúdos fecais e muco com mais C-M-F-P-B-S à temperatura ambiente. Separadamente, corte os intestinos delgado e grosso em pedaços de aproximadamente 1,5 centímetro e coloque os pedaços em tubos cónicos individuais de 50 mililitros contendo 30 mililitros de C-M-F-H-B-S-S pré-aquecido com FBS e dois milimolares de EDTA. Coloque cada tubo cónico de 50 mililitros na posição horizontal em um agitador orbital, agitando os tubos a 250 RPM durante 20 minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, coloque um único coador de malha metálica sobre um balde de resíduos. Despeje o conteúdo de cada tubo cônico de 50 mililitros através da malha para recuperar os pedaços de intestino e, então, coloque-os em novos tubos cônicos individuais de 50 mililitros contendo 30 mililitros de Prewarm C-M-F-H-B-S-S com FBS e 2 milimolares de EDTA. Por fim, devolva os tubos ao agitador orbital por mais 20 minutos.

Após a segunda rodada de agitação, despeje o conteúdo de cada tubo através do funil com peneira. Novamente, remova o meio em excesso usando uma toalha de papel e, em seguida, transfira os pedaços de intestino para um pequeno recipiente plástico de soro. O aspecto mais difícil dessa técnica é a digestão do tecido para garantir o sucesso; todos os parâmetros diferentes — duração da digestão, propriedades da colagenase, integridade do tecido e tamanho do tecido a ser digerido — devem ser considerados rapidamente com o uso de tesoura.

Pique os pedaços intestinais e, em seguida, adicione o intestino picado a um tubo cônico de 50 milímetros contendo 20 mililitros de solução de colagenase. Coloque o tubo cônico na posição horizontal no agitador orbital e digira os pedaços de intestino a 200 RPM durante 10 a 20 minutos a 37 graus Celsius. Agora, vorte o tubo brevemente para garantir a dissociação completa de qualquer tecido intestinal remanescente e, em seguida, filtre a suspensão celular através de um filtro celular de 100 mícrons diretamente em um tubo cônico de 50 mililitros.

Por fim, complete o tubo cônico com C-M-F-H-B-S-S contendo FBS e centrifugue a solução celular duas vezes durante cinco minutos a 425 × g a quatro graus Celsius. Em seguida, despreze o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em C-M-F-H-B-S-S gelado contendo FBS, colocando as amostras no gelo. Após a marcação das células para as proteínas de superfície de interesse.

Comece criando um dot plot excluindo as células que são positivas para a coloração de células mortas, conforme demonstrado aqui. Em seguida, exclua eventos de dupletas como mostrado aqui e aqui. Agora, utilize os canais de dispersão direta e lateral para selecionar as células de interesse, certificando-se de excluir detritos.

Em seguida, crie outro gráfico de dispersão com o gate em CD45 positivo e antígeno IAB positivo. Apresente as células em um gráfico de dispersão separado, criando regiões para distinguir subconjuntos específicos de DC e macrófagos. A região R1 mostrada aqui captura as células CD11c positivas e CD11b fraco/negativas.

A região R dois delimita as células que apresentam um nível semelhante de expressão superficial de CD 11 C às células da região R um, mas que também expressam CD 11 B. As regiões R três designam as células que são positivas para CD 11 B e negativas com baixa expressão (dull) para CD 11 C. Essas três regiões podem ser analisadas posteriormente quanto à expressão de F quatro 80 e CD 1 0 3 para diferenciar as populações de macrófagos e DCs, respectivamente. Como visto neste gráfico de dispersão, as células positivas para CD 11 C e negativas com baixa expressão para CD 11 B na região R um expressarão altos níveis do alfa ein CD 1 0 3 e baixos níveis de F quatro 80.

Este gráfico de pontos mostra que as células CD11B positivas e CD11C positivas na região R2 serão compostas por DCs e macrófagos com base na expressão dicotômica de CD103 e F4/80. Por fim, com base no perfil fenotípico positivo para F4/80 e negativo para CD103 da região R3, as células CD11B positivas e CD11C del negativas selecionadas conterão macrófagos. A relação entre a duração da digestão do tecido e o rendimento total de células, bem como a expressão de CD11B e CD11C, é ilustrada nas seis figuras a seguir. O tecido intestinal digerido por três minutos produz um número baixo de células totais, resultando em poucas DCs e macrófagos disponíveis para caracterização. A digestão do tecido por 11 minutos produz um rendimento robusto de células viáveis, gerando populações de DCs e macrófagos que expressam altos níveis de CD11B e CD11C e que são fenotipicamente distintas.

Em contraste, a digestão por 50 minutos resulta em um rendimento celular semelhante ao da digestão otimizada. No entanto, a delimitação de diferentes populações celulares usando CD11B e CD11C torna-se mais difícil, à medida que a expressão de CD11C diminui e o número de células mortas aumenta.

Assim, ao otimizar os parâmetros para a digestão de tecido intestinal, pode-se obter rapidamente um rendimento celular robusto. Como resultado, o isolamento rápido de DCs e macrófagos intestinais de camundongo pode ser útil para avaliar as propriedades funcionais de células imunes com antígenos de superfície intactos.