A Plataforma de expressão adequada e geral para a produção de proteínas secretadas a partir de células humanas

Neste vídeo, descrevemos um procedimento eficiente em tempo e custo para expressão de proteínas secretadas a partir de células HEK 293T. Inicialmente, uma cultura de células HEK 293T com 40% de confluência é preparada em uma placa de seis poços. Uma mistura de transfeção é então produzida diluindo-se o GeneJuice e os plasmídeos de teste em meio livre de soro.

A mistura de transfeção é depositada sobre as células, que são então incubadas a 37 graus Celsius para permitir a expressão proteica. A detecção da proteína no sobrenadante pode ser realizada por meio de western blot. Uma vez identificado um construto adequado, o procedimento pode ser ampliado utilizando fábricas de células com 10 camadas.

As células são transfectadas utilizando PEI como o reagente de transfeção. As proteínas podem ser isoladas dos sobrenadantes de cultura por meio de filtração tangencial seguida de cromatografia de afinidade. Em última análise, esta plataforma permite a expressão de uma ampla gama de macromoléculas em quantidades da ordem de miligrama.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a expressão em células de inseto baseada em vírus baculovírus, é que um grande número de construtos pode ser analisado e ampliado para expressão, com resultados obtidos em cerca de três semanas. Para demonstrar este procedimento, estarão presentes Hello Aiden, Shada Zini e Jonathan Cook, três estudantes de pós-graduação do meu laboratório. Comece semeando 250.000 células HEC 293T por poço em um volume de um mililitro em uma placa de seis poços, adicionando um mililitro por poço de DMEM suplementado com 10% FBS, e agite suavemente a placa para dispersar as células de maneira uniforme.

Em seguida, incubar as células durante a noite em uma estufa umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Quando as células atingirem uma confluência de cerca de 40%, substituir o meio SUP natum por dois mililitros de meio fresco para preparar a mistura de transfeção. Primeiramente, aliquotar 90 microlitros de DMEM sem soro em um tubo eppendorf.

Em seguida, adicione três microlitros de gene juice, o reagente de transfeção, e misture suavemente o conteúdo do tubo, incubando-o à temperatura ambiente por cinco minutos. A seguir, adicione 10 microlitros de um estoque de 100 nanogramas por microlitro do plasmídeo purificado em mini prep, DNA, a ser transfectado.

Agite o conteúdo do tubo e deixe em repouso à temperatura ambiente por 15 minutos. Para realizar a transfeção, adicione a mistura sobre as células HEC 2 9 3 T. Gotinha a gotinha, agite suavemente a placa para distribuir uniformemente a mistura de transfeção.

Em seguida, incubar as células a 37 graus Celsius. Vinte e quatro horas depois, adicionar um mililitro de meio fresco a cada poço e incubar por mais 48 horas. Três dias após a transfeção, coletar o sobrenadante e detectar os níveis de expressão da proteína de interesse por meio de western blot.

Uma vez que um construto apropriado tenha sido identificado, o procedimento de transfeção pode ser ampliado. Utilizando fábricas de células com 10 camadas, preencha uma fábrica de células com 1,2 litros de DMEM suplementado com 5% de FBS. Em seguida, adicione 200 milhões de células HEC 2 9 3 T, distribuindo as células uniformemente por todas as camadas.

Quatro frascos de cultura celular quadrados de 225 centímetros cúbicos crescidos até 100% de confluência contêm cerca de 200 milhões de células. Incubar as células a 37 graus Celsius durante a noite. Preparar a mistura de transfeção em um frasco T 75 diluindo 840 microgramas de DNA em 84 mililitros de PBS estéril a uma vez.

Adicione 2,5 mililitros de uma solução de polietileno iminada, ou PEI, a um miligrama por mililitro e incube a mistura à temperatura ambiente por 15 minutos. A solução deve ficar turva. Em seguida, despeje lentamente a mistura de transfeção na fábrica de células e distribua-a completamente.

Camadas totais. Adicione ácido valpróico em uma concentração final de quatro milimolar. Isso aumentará os rendimentos de expressão assim que a mistura de transfeção tiver sido adicionada.

Incube a cultura a 37 graus Celsius por quatro dias para permitir a expressão proteica. Recolha o meio quatro dias após a transfeção e imediatamente limpe o frasco de cultura para reutilização; centrifugue o meio coletado a 6.000 G por 30 minutos a quatro graus Celsius e filtre-o através de um aparato de filtração a vácuo com membrana estéril de 0,22 mícron para remover qualquer material particulado. Em seguida, utilize o sistema de filtração tangencial Centra Mate para concentrar o sobrenadante até 75 mililitros.

Uma vez que o sobrenadante é concentrado, a proteína de interesse pode ser purificada por cromatografia de afinidade. Neste experimento, purificamos as subunidades marcadas com HA do domínio extracelular dos receptores humanos AAL dois utilizando o sistema em larga escala descrito aqui, seguido de cromatografia de alta afinidade com anti-HA. Conforme mostrado nesta análise de eletroforese SDS-PAGE corada com Coomassie.

Os domínios extracelulares das subunidades alfa e gama do receptor de interleucina dois migram nos pesos moleculares de 40 quilodaltons e 46 quilodaltons. A heterogeneidade dos glicanos EnLink presentes na IL dois R alfa e na IL dois R gama causou alargamento da faixa no gel de eletroforese SDS-PAGE. A faixa de peso molecular mais alto representa BSA contaminante.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como expressar proteínas a partir de culturas celulares humanas utilizando fábricas celulares de 10 camadas. Não se esqueça de que as células HC 2 93 T são consideradas perigosas biologicamente e devem ser manipuladas no nível de segurança biológica dois. Use sempre roupas de proteção individual adequadas e as superfícies devem ser desinfetadas de acordo com as diretrizes institucionais e governamentais.