Tomografia Computadorizada guiada por tomografia difusa no domínio do tempo de fluorescência em pequenos animais para localização de biomarcadores de câncer
17 de julho de 2012
Tomografia de fluorescência difusa oferece uma abordagem de custo relativamente baixo e com elevado potencial de todo a pré-clínica In vivo Imagem do tumor. A metodologia de coleta de dados ópticos, calibração e reconstrução da imagem é apresentada para uma tomografia computadorizada guiada sem contato do sistema no domínio do tempo usando fluorescente direcionamento do tumor receptor do fator de crescimento epidérmico biomarcador em um modelo de glioma mouse.
O objetivo geral do seguinte experimento é obter imagens de fluorescência da expressão do receptor de fator de crescimento epidérmico em um modelo murino ortotópico de glioma. Isso é alcançado inoculando o hemisfério cerebral esquerdo de um camundongo A IIC com células de glioma humano U2 51 que expressam proteína verde fluorescente. Após o tumor crescer por duas semanas, o camundongo é injetado com um coquetel de dois traçadores fluorescentes.
O camundongo é então submetido a imagem em um sistema de raios-x para pequenos animais para coletar dados anatômicos necessários para a reconstrução precisa da imagem. Os dados são utilizados para posicionar anatomicamente a fonte e detectar as localizações do sistema de tomografia óptica, e um software personalizado é usado para coletar os dados de fluorescência e construir a imagem final. Em última análise, este método pode gerar uma imagem de um tumor com base na sua superexpressão do fator de crescimento epidérmico, utilizando imagens de fluorescência e raios-x, cuja precisão pode ser comparada com a imagem por ressonância magnética com contraste.
A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a tomografia de fluorescência em pequenos animais baseada em dispositivos de acoplamento de carga, é que a detecção por contagem de fótons individuais utilizando tubos fotomultiplicadores oferece uma sensibilidade e uma faixa dinâmica muito maiores para a detecção de luz. Este método pode, em última instância, ser usado para monitorar e avaliar o sucesso de terapias moleculares mediante a medição da expressão de seus alvos. Embora tumores subcutâneos possam ser facilmente visualizados com métodos não tomográficos por imagem de superfície, este sistema foi projetado para realizar imagens através de tecidos com espessura de até vários centímetros, tornando-o especialmente adequado para imagens, contraste, entrega de agentes e detecção de vazamento em tumores cerebrais.
Embora este método possa fornecer informações sobre a expressão de biomarcadores de câncer, ele também pode ser aplicado a outros estudos de doenças, como infecções, obesidade ou aspectos relacionados ao envelhecimento, tais como o Alzheimer. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido à natureza difusa da propagação da luz em tecidos biológicos e à dificuldade em utilizar a tomografia de raios X para a reconstrução da luz difusa. A demonstração visual deste método é essencial.
Como os passos de coleta de dados e reconstrução de imagens podem ser difíceis de aprender, é importante garantir que os dados coletados do sistema fluorescente estejam bem calibrados. O pacote de software near fast foi projetado para ler dados ópticos e usar as imagens de tomografia de raios X para criar uma malha de elementos finitos, que é utilizada como um modelo espacial para o reconstrução da fluorescência. Para começar, posicione um camundongo nu atímico anestesiado sobre um campo cirúrgico estéril e confirme a profundidade da anestesia antes de prosseguir; limpe e desinfete a pele sobre a área de incisão.
Usando Betadine, coloque um campo cirúrgico estéril sobre o local da incisão; com um bisturi, faça uma pequena incisão ligeiramente à esquerda da linha mediana e 0,5 centímetros posterior à linha intraocular. Limpe a superfície do crânio removendo qualquer tecido conjuntivo para que os pontos de referência possam ser identificados. Uma vez exposto o crânio, use uma broca de alta velocidade com uma ponteira estéril de um milímetro para fazer um orifício localizado dois milímetros à esquerda da linha central e dois milímetros atrás do bgma.
Carregue uma seringa Hamilton Micros com uma agulha romba de 27 gauge com as células a serem implantadas. Em seguida, posicione o camundongo sobre um aparelho estereotáxico. Depois, confirme um plano cirúrgico e anestésico profundo com um aperto no dedo do pé e reposicione o campo cirúrgico sobre o animal.
Em seguida, fixe a seringa carregada no estereotáxico. Posicione a seringa sobre o orifício no crânio e insira a ponta da agulha três milímetros abaixo da superfície do crânio. Em seguida, recue a agulha um milímetro para criar um bolsão.
O próximo passo é injetar lentamente as células no hemisfério cerebral esquerdo ao longo de um período de cinco minutos. Após a conclusão da injeção, retire a agulha e limpe o orifício com Betadine. Para impedir que as células cresçam fora do local da injeção, remova o camundongo do estereotáxico e preencha o orifício exposto com cera óssea pré-aquecida.
Por fim, feche o local da incisão com sutura de náilon estéril 5-0. Retorne o camundongo a uma gaiola aquecida e monitore até a recuperação; após a recuperação, injete no camundongo 130 microlitros de 0,1 miligrama por quilograma de buprenorfina por via IP e permita que o tumor cresça por 14 dias antes da imagem. No dia da aquisição de imagens do camundongo, inicie o sistema para permitir que os lasers e detectores de luz aqueçam por aproximadamente 20 minutos.
Para evitar desvios e sensibilidade do sistema, coloque um difusor de linha projetado de 100 graus por quatro graus exatamente no centro do suporte de imagem para dispersar os lasers de excitação entre os canais de detecção do sistema com intensidade igual. Ajuste o ângulo do difusor manualmente para maximizar a quantidade de sinal detectado pelos cinco canais de coleta de luz. Em seguida, coloque a densidade óptica.
Dois filtros de densidade neutra na frente de todos os tubos fotomultiplicadores (PMTs) de detecção de fluorescência e densidade óptica. Um filtro de densidade neutra na frente de toda detecção de transmitância. Os PMTs coletam 100 funções de dispersão temporal de pulso ou T psfs do laser, cada uma com um tempo de integração de um segundo para cada laser sequencialmente, normalizam cada TPSF pela referência do laser, corrigem a deriva temporal na referência do laser e fazem a média sobre todas as iterações para cada detector e cada laser separadamente.
Essas TPS médias são as funções de resposta do instrumento específicas do detector utilizadas na reconstrução da imagem óptica 12 horas antes do procedimento de imagem. Injete o camundongo-teste com um coquetel de traçadores fluorescentes. A calibração precisa do sistema de tomografia fluorescente e a restrição do movimento do animal são os aspectos mais difíceis deste procedimento.
A reconstrução da imagem é tão mal colocada que erros leves na coleta de dados podem levar a erros significativos na imagem reconstruída. Para garantir que os dados coletados sejam precisos, imobilizamos o camundongo da melhor forma possível e repetimos a calibração antes e depois da varredura, aumentando a probabilidade de obtermos uma calibração precisa. Quando estiver pronto, coloque o animal anestesiado sobre os suportes de fibra de vidro da cama de imagem.
Após posicionar a cabeça dentro do cone nasal para anestesia contínua com gás, fixe os dentes na barra de mordida e prenda o animal com fita. O camundongo deve ser colocado aproximadamente no centro do gantry de imagem. Esse posicionamento pode ser orientado pela rotação do laser de excitação em 180 graus ao redor do camundongo, garantindo que o ponto focal do laser ilumine um ponto aproximadamente no centro do animal, a partir da perspectiva do laser, em todos os ângulos.
Uma vez posicionado corretamente, transfira cuidadosamente a maca de imagem e o camundongo para o escâner de micro-TC e colete informações anatômicas com uma resolução isotrópica de 93 micrômetros em toda a cabeça do camundongo. Visualize o conjunto de imagens de TC e selecione as fatias que serão imageadas com o sistema de tomografia por fluorescência. Transfira cuidadosamente a maca de imagem e o camundongo de volta ao sistema de tomografia por fluorescência.
Escolha o número de posições da fonte para cada corte de imagem, o tempo de integração para cada medição TPSF, o número de iterações para cada posição da fonte e a posição e o número de cortes de imagem desejados a partir da pilha de imagens de TC criada anteriormente. Em seguida, coloque filtros na frente dos PMTs de detecção de fluorescência para bloquear toda a luz de excitação e filtros de densidade neutra na frente dos PMTs de detecção de transmitância. Para evitar a saturação desses detectores, execute o software de aquisição de dados coletando TPSFs de fluorescência e de transmitância em cada posição definida entre fonte e detector, em ambos os comprimentos de onda de excitação.
Para cada conjunto de T psfs coletados, monitore e registre a intensidade do laser com um canal PMT de referência. Determine a superfície externa do camundongo e a localização da cama de imagem. Utilize hastes de suporte das imagens de TC e crie máscaras que cubram os limites do camundongo e da haste de imagem.
Separadamente, utilize a máscara do mouse para produzir uma malha de elementos finitos do animal usando o software near fast. Localize as posições da fonte e dos detectores do sistema de tomografia de fluorescência na superfície da malha com base nas coordenadas de registro espacial do micro-TC e da fluorescência. Remova os pontos de dados ópticos associados às posições da fonte ou dos detectores que interagem com a localização da cama de imagem.
As hastes de suporte normalizam os dados coletados em cada posição fonte-detectores pela referência do laser, corrigem a deriva temporal na referência do laser e corrigem as sensibilidades dos filtros, que foram determinadas por testes experimentais no momento da compra. Calcule a razão de Born dos dados para cada posição fonte-detectores e multiplique por uma simulação de modelo direto de transmitância com base na malha animal de elementos finitos para propriedades ópticas uniformes. Isso é feito para mitigar erros associados ao acoplamento do tecido com a fonte ou detector, calibrar os dados ao modelo e ajustar os dados para outros aspectos de discrepância entre modelo e dados; construa um vetor de dados composto pela diferença escalonada dos dados da razão de Born coletados em ambos os comprimentos de onda.
O fator de escala é escolhido para maximizar o contraste da ligação ao EGFR, realizar a reconstrução da imagem no domínio temporal com os dados de diferença calibrados utilizando a TPSF para cada canal de detecção como entrada e criar mapas de fluorescência do traçador direcionado com contraste aumentado observado. A seguir, há um exemplo de uma reconstrução de fluorescência sobreposta a uma imagem anatômica de tomografia computadorizada coregistrada de um camundongo com um tumor de glioma ortotópico U251. O centro de massa do glioma determinado pela reconstrução de fluorescência estava a menos de um milímetro do centro de massa do tumor, determinado por imagem de ressonância magnética com contraste.
O software para aquisição de dados é personalizado para este dispositivo, mas a maioria das técnicas de processamento de imagem pode ser realizada usando o software near fasts disponível em @nearfasts.org. Assim, ao realizar este procedimento, é importante garantir que tanto o sistema quanto os dados sejam calibrados com precisão antes da reconstrução da imagem. Essa calibração exige que as diferenças de sensibilidade e temporais entre os detectores sejam consideradas após a reconstrução da imagem de um traçador direcionado a um biomarcador.
A imagem semelhante de um traçador não direcionado fornece um meio de correção para a captação não mediada por receptores. Isso permite quantificar a quantidade de ligação do traçador, bem como a densidade de receptores in vivo após seu desenvolvimento. Essa técnica inspirou outros pesquisadores a projetar sistemas de tomografia por fluorescência guiados por imagem de raio X, e abriu caminho para a imagem de corpo inteiro de animais maiores.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um experimento de tomografia de fluorescência difusa, que combina sistemas de imagem óptica e imagem anatômica por raios X para a detecção de biomarcadores de câncer.
Visão Geral
Este estudo apresenta um método para produzir imagens de fluorescência da expressão do receptor de fator de crescimento epidérmico em um modelo de camundongo com glioma. A técnica combina imagens de fluorescência e de raios X para melhorar a visualização do tumor e monitorar terapias moleculares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oncologia
- Técnicas de Imagem
Contexto
- A tomografia de fluorescência é uma abordagem promissora para imagem de tumores.
- O receptor do fator de crescimento epidérmico é um biomarcador-chave em gliomas.
- Os métodos de imagem existentes podem apresentar baixa sensibilidade e faixa dinâmica limitada.
- Este estudo tem como objetivo melhorar a imagem através do tecido utilizando técnicas avançadas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para a imagem de biomarcadores tumorais in vivo.
- Comparar a precisão deste método com técnicas tradicionais de imagem.
- Facilitar o monitoramento de terapias moleculares no tratamento do câncer.
Métodos Utilizados
- Inoculação de células de glioma em um modelo murino.
- Injeção de traçadores fluorescentes para imagem.
- Uso de um sistema de raios X para pequenos animais na coleta de dados anatômicos.
- Calibração e reconstrução de imagens utilizando software especializado.
Resultados Principais
- Imagem bem-sucedida da expressão tumoral utilizando dados de fluorescência e raios X.
- Sensibilidade e faixa dinâmica aprimoradas em comparação com métodos tradicionais.
- Potencial demonstrado para monitoramento de terapias contra o câncer.
- Desafios identificados na coleta de dados e reconstrução de imagens.
Conclusões
- Este método fornece uma ferramenta valiosa para a imagem de tumores em estudos pré-clínicos.
- Oferece insights sobre a expressão de biomarcadores de câncer e a eficácia da terapia.
- Uma otimização adicional e treinamento são necessários para novos usuários.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a detecção sensível da expressão do receptor de fator de crescimento epidérmico em modelos tumorais de tecidos profundos, abordando uma limitação fundamental na imagem pré-clínica em oncologia. Ao combinar a tomografia de fluorescência no domínio temporal com a co-registração por microTC, melhora a precisão na localização de biomarcadores e permite a avaliação quantitativa do engajamento do alvo. A abordagem aumenta a confiança preditiva no desenvolvimento terapêutico precoce, fornecendo insights mecanicistas sobre a dinâmica da expressão de biomarcadores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a superexpressão do receptor do fator de crescimento epidérmico como hipótese terapêutica em modelos de glioma.
- Valor Operacional: Fornece leituras quantitativas de fluorescência que apoiam a validação funcional do alvo e a avaliação da densidade de biomarcadores.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança na seleção de alvos ao correlacionar o sinal de imagem com validação histopatológica por meio de ressonância magnética com contraste.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera mapas de fluorescência padronizados e reprodutíveis que refletem a ligação específica do traçador aos receptores da superfície celular.
- Valor Operacional: Apoia a prontidão do ensaio por meio de metodologia com dois traçadores que distingue a captação mediada por receptor da captação não específica.
- Utilidade da Plataforma: Permite fluxos de trabalho de imagem escaláveis para o monitoramento longitudinal da expressão de biomarcadores em estudos pré-clínicos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita o alinhamento translacional de biomarcadores ao quantificar a expressão do receptor do fator de crescimento epidérmico in vivo.
- Valor Operacional: Garante a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica por meio da correlação entre modalidades com ressonância magnética.
- Mitigação de Riscos: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao fornecer dados quantitativos de biomarcadores com resolução espacial.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a otimização do composto inicial, permitindo o monitoramento não invasivo da modulação de biomarcadores em modelos pré-clínicos.
- Biologia de Descoberta: Apoia testes de hipóteses de superexpressão de receptores e ativação de vias em modelos ortotópicos de tumor.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas de fluorescência prontas para ensaios, com alta sensibilidade e ampla faixa dinâmica para avaliação de compostos.
- Análises: Fornece medições de fluxo de fótons no domínio temporal que permitem a reconstrução precisa da distribuição e dos níveis de expressão de biomarcadores.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica por meio de imagem anatômica co-registrada e correlação quantitativa de biomarcadores.
- Reutilização em Ambiente Corporativo: Estabelece uma plataforma de imagem reutilizável, aplicável a diversos tipos de tumores e modalidades terapêuticas na pesquisa oncológica.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos por meio de imagem quantitativa de biomarcadores com resolução espacial.
- Valor Operacional: Fornece aquisição padronizada e reproduzível de dados com sensibilidade superior à tomografia de fluorescência convencional baseada em CCD.
- Valor Estratégico: Aprimora a tomada de decisões de prosseguir/interromper projetos ao reduzir a incerteza biológica na expressão de alvos e no engajamento entre fármaco e alvo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização baseada em risco de candidatos terapêuticos com base na modulação mensurável de biomarcadores em modelos relevantes para a doença.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em imagem óptica, quantificação de fluorescência e manipulação de pequenos animais.
- Depende de hardware para detecção de fótons únicos, sistemas a laser no domínio temporal e infraestrutura de microTC com registro conjunto.
- Necessita padronização entre equipes para protocolos de calibração, normalização de dados e fluxos de trabalho de reconstrução.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes modelos de tumor, químicas de traçadores e sítios anatômicos além do glioma ortotópico.
- Envolve limitações práticas relacionadas a longos tempos de aquisição e calibração complexa dos dados, o que afeta a produtividade e exige treinamento do operador.
