Compreensão formação de padrões Cerebelar

Sou Kathy Millan. Sou professora assistente na Universidade de Chicago, no Departamento de Genética Humana e também no Departamento de Neurologia. Trabalho com o desenvolvimento cerebral, e especificamente com o desenvolvimento do Cere Butler, o cerebelo, a parte do cérebro localizada na região posterior do crânio.

E é mais conhecido por seu papel no desenvolvimento motor, mas descobriu-se que está envolvido em muitas coisas. E é uma parte realmente interessante do cérebro. A Formação de Padrão é o desenvolvimento de padrões em um sistema biológico. E é uma dessas palavras que os biólogos do desenvolvimento usam de maneira um tanto vaga para significar quase qualquer coisa.

E não está realmente claro o que isso significa. Acho que todo biólogo do desenvolvimento lhe daria uma versão diferente do que isso significa para mim. O que isso significa é como o cérebro, ou em particular o cerebelo, sabe distinguir o topo da base, como se define esquerda e direita?

Como você decide qual parte da estrutura será, qual parte? E, uma vez tomadas essas decisões críticas e fundamentais no estágio embrionário inicial, como você reúne toda a estrutura celular para formar a parte do cérebro meticulosamente padronizada que chamamos de Cerebelo? Assim, estamos realmente interessados no desenvolvimento cerebelar e nas informações de padrão no cerebelo em desenvolvimento.

Como o cerebelo é um tecido extraordinariamente padronizado. Ele possui poucas camadas celulares e poucos tipos celulares. Assim, em comparação com outras partes do cérebro, é especialmente, bem, uma estrutura relativamente simples.

E também porque o cerebelo tem uma função muito específica, ou uma das muitas funções, que é a coordenação motora. Quando camundongos ou humanos apresentam anormalidades cerebelares, um dos fenótipos resultantes é a descoordenação motora. Assim, ao longo de cerca de cem anos de genética de camundongos, foram descobertos múltiplos mutantes espontâneos de camundongos, que foram caracterizados até certo ponto, mas também simplesmente isolados e mantidos nas prateleiras do Jackson Labs, onde estão os camundongos com anormalidades motoras.

E um grande número desses camundongos, acredito que mais de cerca de 60 linhagens espontâneas, apresenta anormalidades no desenvolvimento cerebelar. E esse recurso é uma fonte realmente valiosa para investigar quais são os mecanismos de desenvolvimento que orientam a formação do padrão cerebelar. Assim, uma das linhas de pesquisa do meu laboratório concentra-se em utilizar todas as ferramentas provenientes do Projeto Genoma Humano e do Projeto Genoma do Camundongo, e empregar esses reagentes moleculares para identificar os genes que estão mutados em todos esses mutantes espontâneos.

E, ao identificar esses mutantes, adotamos uma abordagem centrada no fenótipo para encontrar genes. Assim, não estamos selecionando genes aleatoriamente e os inativando. Estamos identificando fenótipos e, a partir deles, descobrindo os genes, pois, ao utilizar essa abordagem, estamos encontrando especificamente genes que são particularmente relevantes para o sistema de interesse.

Portanto, o nosso laboratório e muitos outros laboratórios clonaram diversos desses mutantes espontâneos em camundongos. E esses mutantes espontâneos em camundongos levaram a descobertas biológicas realmente interessantes. Porque estamos adotando uma abordagem baseada no fenótipo.

Não estamos partindo de preconceitos sobre que tipo de genes vamos encontrar. Não estamos procurando especificamente análogos de dal ho ou mutações em canais. Estamos identificando os genes ditados pelos fenótipos.

E por causa disso, estamos aprendendo muita biologia nova. Por exemplo, um dos genes ou um dos fenótipos com os quais meu laboratório trabalhou, e juntamente comigo quando era pós-doutorando com outro colega, Jim Linig, trabalhamos em um mutante de camundongo chamado dre, que em alemão significa girador ou girando como um pião. E esses mutantes de camundongo surgiram pela primeira vez em 1929 na Alemanha e vêm se acumulando na Jackson Labs.

Existem múltiplos alelos neste locus específico, e sabia-se que o cerebelo estava incorretamente formado. Assim, todos os tipos celulares cerebelares estavam presentes, mas o padrão do cerebelo era anormal. A parte média estava ausente; essa parte média é chamada de verme.

E descobrimos que havia um fenótipo embrionário precoce nesses camundongos que levava ao fenótipo adulto. E o fenótipo era resultado de uma mutação em um gene chamado LMX one A, que significa caixa contendo domínio homeo de membro um. Assim, o gene LMX one A é realmente um gene muito interessante e importante na biologia do desenvolvimento, pois é um dos genes mais críticos na definição do que é superior no sistema nervoso central ou o que é dorsal.

E sem ter essa mutação rara, ninguém realmente sabia qual era a função deste gene. Na verdade, ele havia sido encontrado por outras razões em células produtoras de insulina no pâncreas. E outras pessoas vinham estudando seu possível papel na diabetes.

Mas, na verdade, verifica-se que o LMX1A, por si só, não tem nenhum papel no desenvolvimento pancreático ou no desenvolvimento das células de islotes. E, de fato, seu papel principal no desenvolvimento é direcionar o padrão dorsal no sistema nervoso central. Quando clonamos pela primeira vez o gene DR, o gene LMX1A, percebemos que ele é expresso apenas na parte dorsal do sistema nervoso central.

E, de fato, não é expresso apenas na parte dorsal do sistema nervoso central ou na placa dorsal, como é chamada ao redor do cerebelo. Na verdade, é expresso na parte dorsal do sistema nervoso central ao longo de todo o comprimento axial do embrião de camundongo. E, de fato, é expresso ao longo de todo o comprimento axial de cada vertebrado que examinamos até agora.

E como é expresso dorsalmente em todos os lugares, raciocinamos que deve ter um papel dorsal em outras partes do, no sistema nervoso central. E então, na verdade, passamos muito tempo caracterizando o fenótipo dos camundongos DR na medula espinhal, porque a medula espinhal é, na verdade, um sistema modelo muito melhor para compreender o desenvolvimento do SNC do que o cerebelo, pois é muito menos complicada tridimensionalmente. Possui uma estrutura tridimensional muito menos complexa.

Mudando para o embrião de galinha, conseguimos aproveitar um grande número de reagentes para descobrir qual era o papel da LMX1A na medula espinhal. E, a partir da medula espinhal, voltamos ao cerebelo. E, francamente, acho que sem a tecnologia de manipulação do embrião de galinha, não teríamos obtido uma boa compreensão do que o gene LMX1A faz. Um pós-doutorando do meu laboratório, Victor Chico, foi a pessoa que realmente conduziu esses experimentos e os desenvolveu.

E ele foi a pessoa que realmente descobriu qual é a função do gene LMX1A e seu papel principal no sistema nervoso central, utilizando o sistema de eletroporação em embrião de galinha. E honestamente acho que não teríamos conseguido avançar tanto quanto avançamos sem a eletroporação em embrião de galinha. Assim, a eletroporação em embrião de galinha é uma tecnologia realmente valiosa, pois permite superexpressar genes rapidamente no sistema nervoso em desenvolvimento da galinha, obter resultados após dois ou três dias de incubação e gerar fenótipos analisáveis.

Se você realmente tentasse realizar manipulações genéticas em camundongos para obter animais transgênicos, isso levaria vários meses; já para modelos de genes nulos, etc., levaria pelo menos um ano e meio. Assim, o sistema de embrião de galinha é um sistema verdadeiramente valioso, pois permite manipular a expressão gênica e identificar fenótipos rapidamente. Por exemplo, quando o LMX1 está superexpresso no sistema nervoso em desenvolvimento do embrião de galinha, particularmente na medula espinhal em formação, ele faz com que toda a parte dorsal do sistema nervoso central ou da medula espinhal se transforme na parte dorsal do sistema nervoso central ou na placa do teto.

E o que isso nos indicou, em conjunto com uma série de outros experimentos realizados por Victor, foi que a LMX1A por si só é responsável por induzir todo o programa de diferenciação da placa dorsal. E isso é importante porque a placa dorsal é um centro de sinalização crítico no sistema nervoso em desenvolvimento. Se você não possui uma placa dorsal, não há secreção de morfógenos para instruir as células adjacentes do tubo neural a se transformarem em neurônios sensoriais dorsais.

E, sem esses sinais, essas células entram em um estado padrão de um tipo celular intermediário. E você perde a maioria dos neurônios dorsais na, na, na medula espinhal, mas também, na verdade, no cerebelo em desenvolvimento. E eu acho que não teríamos conseguido chegar facilmente a essa conclusão usando qualquer outro sistema além do tubo neural de frango.

Estamos muito interessados no desenvolvimento cerebelar, não apenas por causa da biologia básica em sistemas de camundongo e também em galinha, mas também porque os seres humanos apresentam malformações cerebelares. E essas malformações cerebelares humanas são muito pouco compreendidas. Assim, em colaboração com um colega, o Dr. William Dobbins, um dos maiores especialistas mundiais em malformações cerebrais humanas, iniciamos juntos um projeto para identificar genes associados a malformações cerebelares humanas.

E estamos adotando várias abordagens. Uma das principais iniciativas que realizamos foi a criação de um banco de dados de DNA e um banco de dados clínico, nos quais recrutamos mais de 500 pacientes com malformações cerebelares humanas bem definidas, coletamos imagens de ressonâncias magnéticas e as correlacionamos com amostras de DNA, de modo a utilizar esse recurso na busca de genes. Isso porque as malformações cerebelares humanas, na verdade, não são bem categorizadas. E eu diria honestamente que, a cada 10 exames que recebemos por meio de nossos estudos, pelo menos um desses exames apresenta uma malformação que nunca foi descrita e que ainda não havia sido realmente reconhecida anteriormente.

A malformação cerebelar humana mais comum é chamada de malformação de Dandy-Walker, e é a que os clínicos mais reconhecem. Mas, na verdade, trata-se de uma espécie de diagnóstico residual no campo das malformações cerebelares humanas. Qualquer médico, ou muitos médicos, ao observar um cerebelo anormal, o classificam como Dandy-Walker.

E assim recrutamos pacientes para o nosso estudo sobre a malformação de Dandy-Walker e identificamos todos os tipos de malformações cerebelares interessantes e diferentes. Portanto, estamos utilizando esse recurso para descobrir novos genes envolvidos no desenvolvimento cerebelar, porque, como biólogo do desenvolvimento, acredito que os seres humanos são um grande experimento de mutagênese. Eles são uma excelente fonte para identificar novos genes do desenvolvimento.

Portanto, estamos adotando várias abordagens para encontrar esses genes. Uma dessas abordagens consiste em analisar em humanos os genes que identificamos em camundongos e que têm funções no desenvolvimento cerebelar. De fato, identificamos recentemente a primeira mutação humana no gene LMX1A.

Até agora, tem havido aplicações realmente limitadas da nossa pesquisa básica em ciências na pesquisa clínica. Mas isso está mudando rapidamente. À medida que descobrimos genes cada vez novos, podemos fornecer novas informações de aconselhamento genético às famílias de crianças afetadas.

E francamente, é aí que vejo o maior impacto da nossa pesquisa. Assim, minha visão para a área nos próximos cinco anos é que ocorrerá uma descoberta muito maior de genes, tanto por meio da caracterização de modelos de camundongos quanto por meio de estudos em malformações cerebelares humanas. Teremos mais conhecimento sobre o conjunto de genes envolvidos no desenvolvimento cerebelar.

Em seguida, o objetivo terá de ser compreender como esses genes interagem entre si e como esses genes determinam a biologia real. Como eles regulam todos os diferentes eventos celulares que ocorrem para formar um cerebelo? E acredito que o cerebelo é realmente um modelo ideal para todo o sistema nervoso central, porque, francamente, existem apenas cinco a sete tipos principais de células neuronais.

Eles estão todos dispostos de maneiras estereotipadas variadas. Estamos aprendendo cada vez mais sobre as moléculas que orientam a especificação e a diferenciação inicial desses progenitores. Estamos compreendendo cada vez mais como essas células proliferam.

Portanto, acho que em mais de cinco anos, mas, em última instância, vejo a área sendo capaz de acompanhar o desenvolvimento do tubo neural até o desenvolvimento cerebelar completo, alcançando a forma madura do cerebelo. E, como o cerebelo é um sistema relativamente simples, temos a esperança de realmente descobrir as moléculas e os eventos de desenvolvimento que impulsionam a formação de todo o centro do cerebelo inteiro. E acho isso realmente importante, não apenas para a área de diagnóstico genético em humanos e para o campo do desenvolvimento cerebelar, mas também acredito que teremos aplicações desses mecanismos em outras partes do cérebro.

O cerebelo é uma estrutura relativamente simples, mas muitos dos eventos de desenvolvimento não serão exclusivos do cerebelo. Podemos aplicar o que aprendemos com o cerebelo a outras regiões mais complexas do sistema nervoso central, como o córtex cerebral, e utilizar os conhecimentos e as vias que descobrimos para entender como eles se aplicam ao restante do cérebro.