Avaliação de replicação e função das células beta no Adenovirally transduzidas isoladas ilhotas de roedores

O objetivo geral deste procedimento é identificar vias de sinalização que regulam alterações na massa funcional de células beta. Isso é realizado em ilhotas pancreáticas isoladas de rato mediante superexpressão ou supressão da expressão de um gene utilizando vetores adenovirais. Após essa manipulação, a função da célula beta é avaliada pela secreção de insulina e a replicação das ilhotas é medida pela incorporação de timidina tritiada.

No fim das contas, esses ensaios podem demonstrar se um gene de interesse regula a proliferação e/ou função de células beta in vitro. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia da placa da pálpebra, como se um componente específico de uma via de sinalização influencia o crescimento e a função da célula beta. Prepare uma placa de seis poços não revestida para cultura de tecidos adicionando dois mililitros de meio modificado ao número necessário de poços.

Por exemplo, um experimento típico pode exigir três poços, um para controle sem vírus, um para controle com vírus e um para o grupo experimental. Aqueça a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos por pelo menos 30 minutos. Imediatamente após o isolamento dos olhinhos de rato, coloque de um a 200 olhinhos em cada poço da placa preparada. Sessenta olhinhos serão usados para ensaios bioquímicos e os olhinhos restantes podem ser utilizados para estudos de expressão gênica ou imunoblotagem. Agite suavemente a placa para centralizar os olhinhos em cada poço.

Então, imediatamente pipete o adenovírus diretamente sobre os orifícios, no centro da placa. Utilize uma multiplicidade de infecção de 1 a 500, dependendo da eficácia do adenovírus em superexpressar ou silenciar sua proteína de interesse.

A penetração eficiente do adenovírus até o núcleo da pálpebra aumenta a consistência dos resultados. A transdução das pálpebras imediatamente após o isolamento da pálpebra é essencial.

Não perturbe a placa por cinco minutos, depois transfira-a para o incubador por 24 horas. No dia seguinte, retire a placa do incubador e inche suavemente os olhinhos até os centros dos poços. Transfira os olhinhos para um novo poço contendo meio fresco usando uma micropipeta de 200 microlitros.

Se os orifícios aderirem à placa, podem ser suavemente desalojados com a ponta da pipeta. É útil utilizar um vírus controle que expresse GFP para verificar a eficiência adequada de transdução, usando microscopia confocal para visualizar a penetração do adenovírus na cultura do núcleo das ilhotas. As ilhotas por mais um a três dias, trocando o meio diariamente.

O tempo de cultivo deve ser otimizado por meio de estudos pilotos e varia conforme os objetivos experimentais. Nas últimas 24 horas, incorpore timidina tritiada ao meio numa concentração de um microcurie por mililitro de meio. Primeiramente, prepare frescamente 50 mililitros do SAB de trabalho em um tubo cônico de 50 mililitros e aqueça-o em banho-maria a 37 graus Celsius.

Pipete 10 mililitros de SAB de trabalho em um tubo cônico de 15 mililitros e adicione 66,8 microlitros de D-glicose 2,5 molar. Para preparar o SAB com alta concentração de glicose, adicione 44,8 microlitros de D-glicose 2,5 monomolar aos 40 mililitros restantes do SAB de trabalho. Para preparar o SAB com baixa concentração de glicose, rotule em seguida três tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitro.

Para cada poço da placa de seis poços, adicione um mililitro de PBS a cada tubo. Não se esqueça de seguir os protocolos institucionais para o manuseio e descarte dos anéis radioativos. Utilizando um estereoscópio ou microscópio padrão, selecione e transfira 20 anéis de tamanho comparável para cada tubo de microcentrífuga.

Por exemplo, cada tubo pode conter cinco ilhós pequenos, 10 médios e cinco grandes. Embora os resultados sejam normalizados em relação ao conteúdo total de proteína ao final do experimento, é fundamental que os ilhós sejam pareados por tamanho entre os grupos. Após permitir que os ilhós sedimentem no fundo do tubo por gravidade ou por centrifugação, aspirem, pese o PBS com uma micropipeta e, em seguida, prossiga com o preparo dos ilhós para os ensaios bioquímicos.

Para preparar os olhais para o ensaio de secreção de insulina, eles devem primeiro ser pré-incubados com SAB de baixa concentração de glicose. Para isso, adicione 400 microlitros do SAB de baixa glicose aos tubos e coloque-os com as tampas no incubador de cultura de tecidos por 60 minutos. Após uma hora, aspire o SAB de baixa glicose da pré-incubação para medir a secreção basal de insulina. Repita o procedimento de pré-incubação.

No entanto, para medir a secreção estimulada de insulina, utilize 400 microlitros de SAB com alta concentração de glicose em vez de SAB com baixa concentração de glicose e, como antes, incube os anéis durante 60 minutos. Após a incubação em SAB com alta ou baixa concentração de glicose, aspire o SAB para o radioimunoensaio de insulina, que será realizado de acordo com o protocolo do fabricante. Em seguida, prossiga com o ensaio de incorporação de timidina utilizando a mesma coleção de anéis. Inicie com os anéis recém-utilizados no ensaio de secreção de insulina.

Adicione um mililitro de PBS e deixe os orifícios assentarem por gravidade. Em seguida, aspire o PBS com uma pipeta microliterada. Descarte e repita este passo mais uma vez.

Em seguida, adicione 500 microlitros de ácido tricloroacético gelado aos orifícios e incube-os em gelo durante 30 minutos. Centrifugue os tubos a quatro graus Celsius. Em seguida, aspire e descarte o TCA.

Em seguida, adicione 80 microlitros de hidróxido de sódio 0,3 normal e incube as argolas por 30 minutos à temperatura ambiente. Durante esta incubação, vorte as amostras vigorosamente por cinco a 10 segundos a cada 10 minutos. Em paralelo, adicione quatro mililitros de um coquetel de contagem conno safe a tubos de contagem por cintilação líquida de sete mililitros.

Quando a incubação dos orifícios terminar, adicione 50 microlitros dos orifícios a um tubo de cintilação. Agite brevemente o tubo tampado e meça a radioatividade das amostras em um contador de cintilação líquida. Para medir também a concentração de proteína, transfira 10 microlitros de vilas para um ensaio comercial de ácido biónico e siga o protocolo do fabricante.

Posteriormente, durante a análise dos dados, normalize os resultados de acordo com a concentração de proteína utilizando os protocolos descritos. Replicação de ilhotas e função das células beta. Em ilhotas de rato, a superexpressão adenoviral do gene hipotético seis estimulou robustamente a replicação das ilhotas sem alterar a função das células beta.

Expressão aumentada do gene seis, síntese aumentada de DNA medida pela incorporação de timidina, pois a maioria das células no olhete do rato são células beta. Experimentações adicionais poderiam demonstrar que esse aumento na incorporação de timidina é devido a um aumento na replicação das células beta. O ensaio de secreção de insulina demonstrou que a superexpressão do gene seis não alterou uma das funções primárias das células beta, a secreção de insulina em glicose baixa e alta.

O aumento na secreção de insulina em concentrações baixas e altas de glicose reflete a saúde das ilhotas após o tratamento com adenovírus. Se o aumento da expressão do gene seis prejudicasse a função das células beta, isso provavelmente se manifestaria como uma diminuição na insulina secretada em concentrações altas de glicose estimulante. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir a replicação das células beta e a secreção de insulina para determinar se um determinado gene influencia o crescimento ou a função das células beta.