Amostragem Peptidome saliva humana Indígena Usando uma sonda de Ultrafiltração Lollipop-Like: simplificar e melhorar a detecção Peptide de Espectrometria de Massa Clínica

Este estudo do peptídeo salivar utiliza uma sonda de ultrafiltração semelhante a um pirulito, seguida por análise direta em espectrometria de massas nano LC LT Q. Primeiro, monte a sonda LLUF utilizando uma membrana de poliéter de telefone celular e um tubo de etileno propileno. Em seguida, colete amostras de saliva de voluntários e processe-as através da sonda LLUF para obter a amostra salivar.

Em seguida, prossiga diretamente para a espectrometria de massa nano L-C-L-T-Q e analise os dados de amostras de saliva com e sem tratamento com a sonda LLUF. Em última análise, o peptídeo salivar pode ser obtido analisando os dados do L-C-M-S-S e comparando os peptídeos identificados entre as duas amostras. Essa abordagem, que utiliza uma sonda de ultrafiltração semelhante a um pirulito acoplada à análise direta por espectrometria de massa nano LC-LTQ, oferece vantagens fundamentais em comparação com outros métodos, como a digestão de proteínas salivares em peptídeos.

Após análise por espectrometria de massas, o LUF PRO simplifica e purifica a saliva, além de aprimorar a detecção por MS de peptídeos na saliva total para aplicação clínica. Utilize cola epóxi para selar as membranas de celulose poliéter nos bordos das paletas triangulares de polipropileno. Em seguida, conecte um tubo de politetrafluoroetileno (Teflon) ao orifício cilíndrico de um triângulo.

Esterilize as sondas com álcool 70% usando uma espátula de polipropileno durante a noite para avaliar a vedação adequada, imergindo as sondas LLUF em 50 miligramas por mililitro. Solução de dextrano azul por duas horas. Confirme a ausência de dextrano azul nas amostras coletadas.

Recrute voluntários saudáveis com idade entre 20 e 40 anos. Após uma lavagem bucal com água, peça ao sujeito que cuspa amostras de saliva integral em um recipiente resfriado com gelo. Reúna todas as amostras e armazene em gelo.

Imediatamente após a coleta, dirija-se a uma sala com quatro graus Celsius com 200 microlitros de saliva para a amostragem com sondas LLUF. Agora, mergulhe a membrana de poliéter de telefone celular na saliva humana em uma placa de cultura. Crie pressão negativa puxando uma seringa para simular um processo de ultrafiltração para amostragem da saliva.

Em seguida, determine as concentrações proteicas. Prepare uma micrograma por microlitro das amostras proteicas de saliva para análise por espectrometria de massas com cromatografia líquida em nanoescala. Para a análise das amostras, utilizamos uma cromatografia líquida em nanoescala Exigent acoplada online a um espectrômetro de massas Finnegan LTQ. Primeiro, carregue cinco microlitros das amostras de saliva não digeridas na coluna de retenção do sistema de cromatografia líquida em nanoescala por meio do amostrador automático.

Após uma etapa de lavagem, troque a válvula e aplique um gradiente linear de zero a 50% do tampão B na coluna de retenção e na coluna de separação C 18. Usando o modo dependente de dados do Excalibur, colete espectros ms ms dos quatro íons MS mais intensos acima de uma intensidade de um vezes 10 à quarta. Para cada amostra, realize corridas duplicadas de três preparações separadas diferentes.

Em seguida, importe o arquivo de dados para o sistema Sequester Sorcerer Two e selecione a busca contra uma base de dados proteica humana apropriada do NCBI, utilizando especificidade não enzimática. Após a busca com o Sequester, os resultados são automaticamente filtrados, validados e exibidos no Peptide Profit e no Protein Profit com base nos resultados do Sequester. O Peptide Profit estima uma probabilidade abrangente, o valor P, de que a atribuição de um peptídeo esteja correta ou incorreta, além de identificar informações adicionais sobre cada sequência de peptídeo.

O lucro proteico calcula uma pontuação de probabilidade de zero a um para cada proteína com base em peptídeos atribuídos aos espectros de Ms.Ms. Esta seção determina a capacidade das sondas LLUF de remover bactérias orais para cultura de detecção bacteriana, coletando amostras de saliva antes e depois da coleta com a sonda LLUF em placas de ágar para um teste de bactérias aeróbias. Utilize placas de ágar LB sem antibióticos a 37 graus Celsius por um dia e, para bactérias anaeróbias, utilize pacote de gás para cultura.

A amostra foi incubada em caldo BHI, em placas com agitador sob condições anaeróbicas a 37 graus Celsius por um dia. A fabricação de dispositivos semelhantes a pirulitos, com ultrafiltração, facilita a coleta de saliva em um ambiente oral simulado. Neste sistema, uma membrana de celulose com carga negativa e limite de peso molecular em 30 quilodaltons é colada a uma paleta de polipropileno e posicionada à frente da sonda LLUF para filtrar as proteínas maiores presentes na saliva.

Para simular o ambiente oral humano, uma esponja é embebida em saliva utilizando uma seringa. A saliva é filtrada e coletada por meio do tubo conectado. A comparação de cromatogramas de LC da saliva antes e após a amostragem com LLUF levou à identificação de peptídeos salivares indígenas por espectrometria de massas nano LC-LT-Q.

Como esses cromatogramas diferenciais são obtidos sem digestão química ou enzimática, eles simplificam o preparo da amostra para fins clínicos. Nesta amostra. Após a elucidação por LLUF das diferentes composições proteicas, foram identificados 131 peptídeos na saliva não digerida.

Esses peptídeos são fragmentos derivados de várias proteínas ricas em prolina. Actin alpha amylase alpha one globin beta globin, his sustain one keratin, one mucin seven polymeric immunoglobin receptor serin e S 100. A 9 26 peptídeos únicos identificados na saliva após filtração com sondas LLUF são fragmentos derivados principalmente de várias proteínas ricas em prolina.

Este peptídeo derivado da alfa amilase foi detectado exclusivamente em uma amostra de saliva sem coleta com sondas LLUF, ilustrando a capacidade das sondas LLUF em remover proteínas grandes. De forma mais intrigante, após a remoção das proteínas maiores, vários peptídeos de sequência foram detectáveis na saliva coletada com as sondas LLUF, notavelmente peptídeos com terminações ricas em prolina foram identificados nas amostras após filtração ultra-rápida com sondas LLUF. Agora você deve ter uma boa compreensão de como usar o PRO A-L-L-L-L-U-F para saliva simples em massa.

Uma análise melhor é muito importante para coletar saliva simples em condições consistentes. Uma vez dominado, acredito que esta técnica possa ser realizada corretamente dentro de três horas. Esta abordagem com uma sonda de ultrafiltração semelhante a um pirulito, acoplada à análise direta por nano-LC-MS/MS em cadeia espectral, facilita aplicações clínicas para biomarcadores no diagnóstico de doenças humanas.