NADH Fluorescência de Imagem biventricular isolado de coelho

O objetivo geral deste procedimento é estudar o metabolismo. Utilizando a imagem de NADH em uma preparação de coração funcionando, isso é realizado primeiramente isolando o coração de coelho. O segundo passo do procedimento é canular com sucesso as quatro câmaras do coração para obter um modelo de coração funcionando.

O passo final consiste em configurar o equipamento de imageamento e coletar dados de NADH em diferentes taxas de estimulação. Em última análise, os resultados podem demonstrar alterações metabólicas do coração por meio da imagem de NADH fluorescente. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a perfusão retrograda de Langendorff, é que o coração está operando em seu estado fisiológico, com fluxo na direção normal e com o próprio coração gerando a pressão necessária para a perfusão coronariana.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na eletrofisiologia e nos mecanismos de arritmias letais. Isso é feito por meio de um modelo fisiológico para estudar a ligação entre o metabolismo do fluxo coronariano e a atividade elétrica. A demonstração visual deste método é essencial porque os passos de cânula nas artérias e câmaras cardíacas são difíceis de aprender.

Técnica inadequada pode danificar o coração e comprometer o restante do experimento. Antes de realizar um experimento, enxágue todos os tubos nas câmaras do sistema de coração isolado com água purificada e, em seguida, remova a água do sistema acionando as bombas. Adicione filtros de membrana de celulose em linha com a bomba de perfusão LOR, a bomba de perfusão do coração esquerdo e a bomba de perfusão do coração direito.

Após adicionar o PERFUSE oito ao sistema, realize uma calibração de dois pontos para cada sensor de pressão. Ligue o banho de água aquecido e circulante que aquece os tubos com jaqueta de água e os trocadores de calor. Ligue o banho de água, utilizado para aquecer o PERFUSE oito.

Ligue as bombas que circulam o PERFUSE oito em um circuito fechado, ligue o tanque de circulação para oxigenar o Perfuse. Oito, certifique-se de que o oxigenador de microfibra ou os filtros hemáticos estão fornecendo 95% de oxigênio ao perfusato oito a 80 quilopascal. Por fim, verifique se os trocadores de calor estão mantendo a temperatura do perfusato em circulação.

Oito a 37 graus Celsius, inicie a excisão cardíaca configurando primeiro o sistema cardíaco de trabalho para operar em pressão constante. Modo LRF. Ajuste a pressão do bloqueio aórtico entre 50 e 60 após sedar um coelho.

Injete pentobarbital e heparina na veia marginal da orelha ou na veia safena lateral na face interna do membro posterior. Assim que o coelho perder o reflexo de dor, abra rapidamente a cavidade torácica. Corte o pericárdio, prenda a aorta e excise o coração e os pulmões.

Os pulmões são mantidos presos para facilitar o isolamento das veias pulmonares. Em seguida, encha uma seringa com 60 mililitros por F oito e 200 unidades de heparina. Fixe uma cânula de cinco milímetros e cânule a aorta.

Fixe a aorta à cânula com suturas de seda número zero. Em seguida, pressione lentamente a seringa para lavar o sangue através do coração. Monte o sistema de coração funcionando conectando primeiro o coração ao bloco aórtico.

Aproxime-se do conector em um ângulo oblíquo e permita que o Perfuse oito a goteje suavemente do conector para a cânula enquanto estiver conectado. Isso impede que o ar entre na aorta, prevenindo assim embolias coronárias enquanto o coração é perfundido em pressão constante. Modo L endorf.

Remova a gordura e o tecido conjuntivo e localize os seguintes vasos. Veia cava inferior e superior, veia aorta, artéria pulmonar e veias pulmonares. Em seguida, ligue a veia cava superior.

Corte a artéria pulmonar logo abaixo do ponto em que se divide nas artérias pulmonares direita e esquerda. Os vasos restantes são as veias pulmonares. Agrupe-as entre o coração e os pulmões e ligue todas usando um único ponto de sutura.

Isso é crítico por duas razões. Primeiro, amarrar os vasos conectados aos pulmões garantirá que não haja vazamento assim que a cânula for colocada. E segundo, é importante isolar ambas as veias cavas para a cânula posterior.

Agora remova os pulmões. Corte um orifício de tamanho apropriado no canto da aurícula esquerda e certifique-se de que esteja cheio com profuse eight. Em seguida, canule a aurícula enquanto a cânula estiver completamente preenchida com perfuse eight.

Em seguida, enquanto segura o tecido, suturar a cânula à apêndice. O tecido do apêndice auricular esquerdo é extremamente delicado e pode rasgar facilmente. Por isso, é importante canular o átrio esquerdo na primeira tentativa, caso contrário pode não ser mais possível.

Ligue a bomba número dois para fornecer fluxo ao átrio esquerdo. Ajuste a pré-carga entre dois e seis tor durante todo o experimento. Pode ser necessário ajustar a pressão.

Mantenha-o dentro de dois milímetros da pressão alvo. Agora, mude o coração para o modo de coração funcionando desligando momentaneamente a bomba número um, a bomba de Langendorff. Reduza a pressão aórtica para dez torr e, em seguida, aumente lentamente até a faixa de 80 a 100 torr.

Isso permite que a válvula aórtica se abra e funcione como o faria durante condições fisiológicas normais. Ajuste a pressão final de pós-carga para um valor que seja aproximadamente 20 unidades menor que a pressão pico do VE, utilizando uma cânula diretamente conectada ao sistema.

Realize a cânula no átrio direito através da veia cava inferior e fixe a cânula com sutura na veia. Evite introduzir bolhas de ar. Ligue a bomba número três, a bomba do lado direito, para fornecer fluxo ao átrio direito.

Regule a pressão para aproximadamente três torr. Por fim, canule o ventrículo direito sem permitir a entrada de ar e sutura a cânula à artéria pulmonar. Isso conclui a canulação biventricular.

Agora prossiga para a aquisição do sinal. Insira cuidadosamente o cateter do transdutor de pressão na aorta por meio da cânula da aorta. Navegue suavemente por dentro da válvula aórtica e até o ve.

O sinal de pressão do VE aparecerá conforme esperado quando a ponta do cateter estiver adequadamente posicionada. Em seguida, pressione suavemente o eletrodo de potencial de ação monofásico contra o epicárdio ventricular. Um leve artefato de movimento no sinal do eletrodo é normal.

Em seguida, posicione um eletrodo bipolar de estímulo sobre o átrio direito para estimular o coração de acordo com a posição definida no desenho experimental. E foque a câmera CCD na região de interesse do coração. Deve haver um filtro de emissão acoplado à câmera.

Para detectar a fluorescência do NADH, desligue as luzes ambiente para iluminar uniformemente o epicárdio com uma fonte de luz ultravioleta na estação de trabalho, à qual a câmera está conectada. Configure o software para adquirir imagens a duas quadros por segundo. Em seguida, selecione o modo de atualização contínua para monitorar a intensidade média dos pixels dentro da região de interesse.

Se a perfusão foi adequada, os níveis de NADH representados pela fluorescência devem ser baixos e estáveis sobre a superfície epicárdica. Agora, execute o experimento quando estiver completo. Remova o coração.

Drene o PERFUSE oito e os tubos e câmaras do sistema com água purificada. Enxágue periodicamente o sistema com solução TM mucosal ou uma solução diluída de peróxido de hidrogênio utilizando o protocolo descrito. Os corações foram estimulados em comprimentos de ciclo entre 200 e 400 batimentos por minuto.

A pressão ventricular esquerda diastólica (PVE) geralmente estava entre zero e 10 tor; a pressão aórtica diastólica mínima era aproximadamente 60 tor. A pressão ventricular esquerda sistólica de pico depende da pressão de enchimento e da contratilidade, e idealmente deveria estar entre 60 e 80 tor; a pressão aórtica máxima e a PVE máxima deveriam ser muito semelhantes. Os potenciais de ação monofásicos típicos do coração de coelho apresentam uma fase de despolarização rápida e uma fase de repolarização característica. Os potenciais de ação foram facilmente registrados nas preparações, mas geralmente apresentavam um pequeno artefato de movimento durante a diástole.

Valores médios de NADH fluorescente de uma região de interesse na caixa vermelha foram medidos para monitorar alterações no estado redox mitocondrial durante três ciclos de estimulação com durações de 300, 200 e 150 milissegundos, quando a frequência de estimulação estava próxima ao ritmo sinusal. O nível basal de NADH foi relativamente constante à medida que o ciclo foi encurtado. Abaixo de 300 milissegundos, os níveis basais de NADH aumentaram, com o maior aumento ocorrendo em 150 milissegundos; o sinal oscila com a contração e a frequência da oscilação corresponde à frequência cardíaca.

A amplitude dessas oscilações foi sempre menor do que qualquer tendência em escalas de tempo mais longas causada por isquemia ou hipóxia. A imagem fluorescente de alta resolução do NADH na superfície anterior completa a 200 batimentos por minuto foi constante e espacialmente homogênea a 400 batimentos por minuto. Os níveis de NADH aumentaram substancialmente em todo o epicárdio.

Observou-se uma heterogeneidade espacial significativa, com os maiores aumentos ocorrendo nas regiões septais do VD e do VE uma vez dominada a técnica. Este procedimento pode ser realizado em menos de 45 minutos, se for executado corretamente. Ao tentar realizar este procedimento, é importante lembrar-se de evitar que bolhas de ar entrem na aorta ou no átrio esquerdo após este procedimento.

Métodos adicionais, como carregar o coração com um corante sensível à voltagem, podem ser utilizados para responder perguntas adicionais, como relacionar a atividade elétrica e metabólica na superfície do coração durante cenários patológicos, tais como isquemia local, após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores em fisiologia cardíaca estudarem o metabolismo cardíaco e distúrbios de condução durante condições patológicas, utilizando um modelo mais fisiologicamente relevante.